反相高效液相色谱法测定常见食品中乳酸、富马酸的含量

2022-02-16 11:30:28 来源：食品安全导刊

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陈振中

(中科检测技术服务(广州)股份有限公司，广东广州 510000)

摘　要：为测定常见食品中乳酸、富马酸的含量，建立了常见食品中乳酸、富马酸提取及反相高效液相色谱的测定方法。本实验选用葡萄酒、含乳饮料、糕点为基质，添加乳酸、富马酸标准品混匀，用水浸泡超声提取、稀释至刻度，摇匀，5 000 r/min离心10 min，上清液过0.45μm 无机滤膜后，以高效液相色谱反相C18柱分离，通过PDA二极管阵列检测器检测。检测结果显示，以上3种基质用该测定方法检测的平均回收率分别为乳酸97.7%、95.5%、99.1%，富马酸96.3%、95.5%、97.9%;相对标准偏差分别为乳酸1.1%、1.5%、4.4%，富马酸1.2%、1.0%、0.3%。

关键词：常见食品;乳酸;富马酸;反向高效液相色谱法;PDA二极管阵列检测器

富马酸即名延胡索酸，富马酸可作为酸度调节剂、酸化剂、抗氧化助剂、腌制促进剂和香料使用。本品有强缓冲作用，保持水溶液pH在3.0左右，并对抑菌防霉有重要作用，同时有涩味，是酸味极强的固体酸之一，吸收率低，有助于延长粉末制品等的保存期。当富马酸变为富马酸钠后，水溶性及风味均更好。乳酸有很强的防腐保鲜功效，可用在果酒、饮料、糕点等食品中具有调节pH值、抑菌、延长保质期、调味、保持食品色泽和提高产品质量等作用，食品中加入一定量的乳酸，可保持产品中的微生物的稳定性、安全性，同时使口味更加温和[1]。

现行有效的高效液相色谱法检测食品中的富马酸、乳酸的方法一般局限在饲料、果汁、农产品等，鲜有运用高效液相色谱法同时测定食品中的富马酸、乳酸的方法。本实验建立了常见食品中乳酸、富马酸提取及反相高效液相色谱的测定方法，选用含乳饮料、葡萄酒、糕点为基质，添加乳酸、富马酸标准品混匀，用水浸泡、稀释至刻度，摇匀，5 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm无机滤膜后作为样液，然后以高效液相色谱反相C18柱分离，通过PDA二极管阵列检测器检测[9]。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

供试含乳饮料(原味椰子果粒酸奶饮品，广州市贝奇饮料有限公司生产);供试葡萄酒(菲芃庄园葡萄酒，广州市圣罗伦酒业有限公司生产);供试糕点(核桃包，广州包多宝食品有限公司生产);乳酸标准品(含量89.9%，英国LGC公司);富马酸标准品(含量99.2%，英国LGC公司);磷酸二氢铵(分析纯，广州化学试剂厂);超纯水(电阻率为18.2 MΩ·cm)。

1.2　仪器与设备

Alliance e2695高效液相色谱系统(美国Waters公司);2998 PDA Detector光电二极管阵列检测器(美国Waters公司);Uranus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm，广州菲罗门科学仪器有限公司)，电子分析天平(GH-252，广州市艾安得仪器有限公司);超声波清洗机(GT-2013QTS，广东固特超声股份有限公司);低速离心机(KA-1000，上海安亭科学仪器厂);Cascada I 超纯水仪(美国PALL公司)。

1.3　实验方法

1.3.1　乳酸、富马酸标准溶液配制

秤取乳酸标准品55.6 mg、富马酸标准品50.4 mg，分别加水转移至50.0 mL容量瓶中，定容至刻度，配置成浓度均为1.0 mg/mL的乳酸、富马酸标准储备溶液。分别吸取适量乳酸、富马酸标准储备溶液于50.0 mL容量瓶中，配制成6个不同浓度混标(包括空白试样)。乳酸标准曲线浓度范围：0 μg/mL、8.33 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL、250.00 μg/mL;富马酸标准曲线浓度范围：0 μg/mL、0.083 3 μg/mL、0.250 0 μg/mL、5.000 0 μg/mL、10.000 0 μg/mL、25.000 0 μg/mL。

乳酸、富马酸在上述浓度范围内呈线性关系。线性回归方程分别为：乳酸Y=16.733-11.673、富马酸Y=8.180-5.590。相关系数分别为：乳酸R=0.999 97、富马酸R=0.999 98

1.3.2　高效液相色谱条件

色谱柱：Uranus C18色谱柱4.6 mm×250 mm×5 μm;流动相：1 mol/L磷酸二氢铵溶液，磷酸调节pH=2.5;流速：0.6 mL/min;检测波长：210 nm;柱温：40 ℃;进样体积：10 μL。

1.3.3　样品前处理

取有代表性样品500 g混合均匀，装入洁净容器内密闭并标明标记，于4 ℃保存。秤取样品约5 g(精确到0.000 1 g)于50 mL容量瓶中，25 mL超纯水水浸泡1 h，超声提取1 h，稀释至刻度，摇匀，5 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm无机滤膜后作为样液，供HPLC测定。

1.3.4　流动相pH值相关性实验

配制1 mol/L磷酸二氢铵溶液并用磷酸调节pH值，分别配制成pH=2.0、pH=2.5、pH=3.0的1 mol/L磷酸二氢铵溶液，分别以此作为流动相上机检测，其他色谱条件不变。收集乳酸、富马酸标样保留时间、峰宽、分离度，分析两者与流动相pH值的相关性，选择最优流动相pH值进行后续

实验。

1.3.5　方法检出限实验

选用信噪比法确定方法检出限。分别称取500.0 g3种基质样品各3份，并分别添加乳酸、富马酸标准物质10.0 mg、0.10 mg;50.0 mg、0.50 mg;100.0 mg、1.00 mg，每种基质样品中乳酸、富马酸样品浓度水平分别为20.0 mg/kg、0.20 mg/kg;100.0 mg/kg、1.00 mg/kg;200.0 mg/kg、2.00 mg/kg。称取适量样品前处理后上机检测，确定本实验室对本方法的检出限。

1.3.6　方法回收率与重复性实验

称取葡萄酒、含乳饮料、糕点3种基质样品500.0 g各两份，样品中分别添加乳酸、富马酸标准物质125.0 mg，1.25 mg样品浓度水平为乳酸250.0 mg/kg、富马酸2.50 mg/kg。按照本文样品前处理方法提取及净化处理样品得到1.0 mL样液，用高效液相色谱分析。

2　结果与分析

2.1　流动相pH值相关性

实验数据如表1所示。由表1可知，当流动相pH=2.5、pH=3.0时，分离度(R)分别为3.183、7.821，均>2，有较好分离度。当流动相pH=2.5时，所有待测物完全出峰所需时间适中，且分离度(R)>2，所以后续实验流动相pH均选择pH=2.5。标准样中目标物的色谱图见图1;葡萄酒、含乳饮料、糕点3种基质中目标物色谱图分别见图2～4。

2.2　方法检出限

本文主要选用信噪比法进行研究。峰高及基线最大波动值数据如表2。由表2可知，乳酸浓度水平为100.0 mg/kg、富马酸度水平为0.020 mg/kg时，信噪比明显，分别为5倍、2倍，所以本实验以乳酸浓度水平100.0 mg/kg、富马酸度水平0.020 mg/kg为方法检出限，与行业标准《进出口果汁中乳酸、柠檬酸、富马酸含量检测方法高效液相色谱法》(SN/T 2007—2007)方法检出限相近，符合要求。

2.3　方法回收率与重复性实验

用高效液相色谱分析，每种基质样品重复测定6次，进行加标回收和精密度实验，结果计算=实验数据如表3所示。本次实验样品基质空白为0，样品浓度水平为乳酸250.0 mg/kg、富马酸2.50 mg/kg，葡萄酒、含乳饮料、糕点3种样品基质平均添加回收率分别为乳酸97.7%、95.5%、99.1%，富马酸96.3%、95.5%、97.9%;相对标准偏差分别为乳酸1.1%、1.5%、4.4%，富马酸1.2%、1.0%、0.3%，结果表明该方法精密度、重现性良好。