于金英，王 津，全奕洁，汪 冶*

(丽水学院，浙江丽水 323000)

摘 要：基于多实验指标考察优化莲房原花青素超声波辅助提取工艺。运用正交试验设计通过对3个试验指标包括莲房原花青素(LSPC)提取率、低聚莲房原花青素(LSOPC)提取率、高聚莲房原花青素(LSPPC)提取率进行考察优化超声波辅助提取工艺参数，采用层次分析法(AHP)确立权重确定优化工艺。超声辅助提取优化工艺结果为乙醇体积为50%，料液比1∶15，提取4次，提取30 min。基于多实验指标的优化工艺能更加客观地反映莲房原花青素的提取效果。

关键词：超声波辅助提取;原花青素;多指标考察;层次分析法

莲房(莲蓬)是莲的成熟花托，是莲子收获过程中产生的副产物，一般在莲子采收过程中被丢弃。莲房与葡萄籽相似，含有大量原花青素成分，原花青素是由不同数量的儿茶素或儿茶素单体及其聚合体形成的多酚化合物组成的，按照聚合度的不同以及单体的构象或键合位置的不同可形成多种化合物，一般分为低聚体OPC(聚合度=2～4)和高聚体PPC(聚合度≥5)。聚合体的抗氧化能力随着聚合度的增大而降低，且低聚体(OPC)较高聚体(PPC)具有良好的生物利用度[1]。为了有效利用莲房原花青素(Procyanidins Of Lotus Seedpod，LSPC)，本研究利用层次分析法(The Analytic Hierarchy Process，简称AHP法)开展多指标优选的综合评价，通过对3个实验指标：莲房原花青素(LSPC)提取率、低聚莲房原花青素(LSOPC)提取率、高聚莲房原花青素(LSPPC)提取率进行综合评估，可以更加客观地反映处州白莲莲房中莲原花青素(LSPC)的提取效率和质量。

1 材料与方法

1.1 材料

处州白莲蓬购于丽水市莲都区老竹镇处州白莲种植基地，剥除莲子，将莲蓬自然阴干。

1.2 仪器与试剂

SG250H超声波提取器、HX-5FD真空冷冻干燥设备。儿茶素标准品(上海源叶生物科技有限公司)、硫酸、香草醛、甲醇、乙醇。

1.3 实验方法

1.3.1 莲房原花青素提取

选用阴干的去除莲子的干燥莲房若干，用高速粉碎机粉碎，过24目筛，称取适量粉末，加入一定量的乙醇，超声提取，离心过滤得到提取液。提取液经过薄层旋转蒸发仪回收酒精后，剩余水溶液进行冷冻干燥处理制备莲房原花青素(LSPC)样品。

1.3.2 低聚莲房原花青素(LSOPC)和高聚莲房原花青素(LSPPC)样品制备

利用莲房原花青素中低聚体和高聚体溶解性差异进行分级分离。将上述制备的莲房原花青素样品溶于水，首先采用等体积乙酸乙酯萃取3次富集低聚莲房原花青素，回收溶剂制备低聚莲房原花青素(LSOPC)样品，萃取后的水溶液经冷冻干燥制备高聚莲房原花青素(LSPPC)样品。

1.3.3 莲房原花青素含量的测定

(1)儿茶素标准曲线的绘制。准确称取儿茶素标准品25 mg，用70%乙醇溶解并定容至25 mL，配制儿茶素标准贮备液1 mg/mL。分别移取儿茶素标准贮备液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL至25 mL容量瓶中，加入70%乙醇定容，制备得到浓度为0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL和0.20 mg/mL的儿茶素标准品溶液。分别移取上述不同浓度的溶液0.5 mL置于10 mL比色管中，然后依次加入2.5 mL的30 g/L香草醛-甲醇溶液和2.5 mL的30%硫酸-甲醇溶液，在30 ℃水浴里避光反应15 min，在波长500 nm处测定吸光值，以儿茶素浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制儿茶素的标准曲线[2]。

(2)莲房原花青素提取率的计算。取1.3.1和1.3.2项制备的样品，按照(1)项操作。用70%乙醇作为待测液，在相同条件下，作一组空白对照试验。利用儿茶素标准曲线的回归方程计算提取液中原花青素的质量浓度，然后计算莲房原花青素的提取率。

式中：n 为提取液稀释倍数;c 为提取液中原花青素的质量浓度，mg/mL;V 为提取液体积，mL;m为莲房样品质量g。

在单因素试验基础上，选用乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)4 个因素，以 LSPC 提取率(X)、LSOPC 提取率(Y)、LSPPC提取率(Z)为指标，采用 L9(34)正交试验设计优化提取工艺。

1.3.5 单因素实验

原花青素结构中含有多个酚羟基，易溶于水、甲醇、乙醇和稀酸等极性溶剂中 [3-4]，因此选择酒精溶液作为莲房原花青素的提取剂，采用超声波辅助进行提取，以 LSPC 提取率(X)、LSOPC 提取率(Y)、LSPPC 提取率(Z)为考察指标，分别考察乙醇体积分数(40%、50%、60%、70% 和 80%)、料液比(1︰10、1︰15、1︰20、1︰25和 1︰30)、提取时间(10 min、15 min、20 min、25 min和30 min)、提取次数(1次、2 次、3 次、4 次和 5 次)等因素对莲房原花青素提取效果的影响。按照 1.3.1 和 1.3.2 项制备样品，然后按照(1)项操作，最后按照 1.3.3 中(2)分别计算提取率。

1.3.6 正交试验设计优化提取工艺

在单因素试验基础上，确定提取工艺影响因素水平。选用乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)4 个因素，以 LSPC 提取率 % (X)、LSOPC 提取率 %(Y)、LSPPC 提取率 %(Z)为指标，采用 L9(34)正交试验设计优化提取工艺。按照多指标权重分析进行综合总评分，并进行直观分析与方差分析。

1.4 AHP法确定指标权重

1.4.1 建立优先矩阵

为了优化莲房原花青素的抗氧化活性部位提取工艺，将LSPC提取率(%)、LSOPC提取率(%)、LSPPC提取率(%)作为权重指标予以量化，即将3个指标分为3个层次，并确定各指标的优先顺序为：LSOPC提取率%()>LSPC提取率%()>LSPPC提取率%()，构建成对比较的优先判断矩阵，同时赋予各指标相对评分，见表1。

1.4.2 归一化权重系数

1.4.3 一致性比率

CR=CI/RI，作为衡量所得权重系数是否合理的指标，经计算一致性比例因子 CR=0.008 9，CR < 0.10即指标比较的优先判断矩阵具有满意的一致性，所得权重系数有效。

2 结果与分析

2.1 儿茶素标准曲线

采用1.3.1的方法，绘制出儿茶素的标准曲线如图1所示。

2.2 莲房原花青素提取工艺优化的单因素试验结果

2.2.1 不同因素对莲房原花青素(LSPC)提取的影响

以莲房原花青素(LSPC)的提取率(%)为评价指标，采用单因素实验方法考察乙醇体积分数(%)、料液比(g/mL)、提取时间(min)、提取次数(次)4个不同因素对评价指标的影响，得到结果如图2所示。研究结果显示，乙醇体积分数在60%，料液比1︰20，提取时间25 min时莲房原花青素(LSPC)的提取率较高，提取次数(3次和4次)差别不明显，从实际操作角度考虑，选择采用提取4次作为单因素试验优化结果。

2.2.2 不同因素对莲房原花青素(LSOPC)提取的影响

以莲房原花青素(LSOPC)的提取率(%)为评价指标，采用单因素实验方法考察乙醇体积分数(%)、料液比(g/mL)、提取时间(min)、提取次数(次)4个不同因素对评价指标的影响，得到结果如图3所示。研究结果显示，乙醇体积分数在60%，料液比1︰20，提取时间20 min时莲房原花青素(LSOPC)的提取率较高，提取次数(3次、4次、5次)差别不明显，从实际操作角度考虑，选择采用提取4次作为单因素试验优化结果。

2.2.3 不同因素对莲房原花青素(LSPPC)提取的影响

以莲房原花青素(LSPPC)的提取率(%)为评价指标，采用单因素实验方法考察乙醇体积分数(%)、料液比(g/mL)、提取时间(min)、提取次数/(次)4个不同因素对评价指标的影响，得到结果如图4所示。研究结果显示，乙醇体积分数在60%，料液比1︰15，提取时间20 min，提取3次时莲房原花青素(LSPPC)的提取率较高。

2.3 正交优化实验结果

根据2.2项的单因素试验结果，最终确定提取工艺影响因素水平，见表2。

按照正交试验 L9(34)进行试验，分别计算实验结果 X、Y 和 Z 值，以 1.4.2 确认的权重分别计算出 9 组正交试验综合评分(M)，总得分(M)=0.539 6Y+0.297 0X+ 0.163 4Z，结果见表 3。

以综合评分为标准，对表 3 中数据直观分析表明(表 4)，优化提取工艺为 A1B2C3D2，方差分析结果(表 5)显示因素 A、B、C、D 对实验结果均无显著影响，最终确认生产工艺为 A1B2C3D2，即加入 50% 乙醇，料液比 1 ︰ 15，超声提取 4 次，每次 30 min。

2.4 验证试验

取莲房样品适量，按照优化提取工艺进行验证试验，分别测定LSPC、LSOPC和LSPPC提取率，结果见表6。所得工艺简便、稳定、可行。

3 结论与讨论

超声的机械作用和空化作用可以破坏细胞壁，加强细胞内有效成分的传递作用，且不会改变小分子化学成分的结构与性质，可以加快细胞内代谢产物的溶出速度[5]。因此，较一般常规溶剂加热提取方式提取时间更短，提取效率更高。

层次分析法(The Analytic Hierarchy Process，简称AHP法)是一种解决多目标的复杂问题的定性与定量相结合的决策分析方法，判断和衡量目标能否实现的标准之间的相对重要程度，并合理地给出每个决策方案的各标准的权数，利用权数求出各方案的优劣次序[6-7]。

本实验综合考虑莲房中总原花青素(LSPC)、低聚莲房原花青素(LSOPC)、高聚莲房原花青素(LSPPC)提取率，以乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数为考察因素，采用层次分析法、多指标加权综合分析法，利用正交设计优选原花青素的提取效率。优化后的工艺具有良好的重现性、稳定性和可操作性。