任嘉瑜1,2，范 娜1*，彭晓邦1,2

(1.商洛学院健康管理学院，陕西商洛 726000;

2.陕西“四主体一联合”秦岭健康食品配料及核桃产业技术校企联合研究中心，陕西商洛 726000)

摘 要：本研究以商洛枳壳为原料，通过单因素试验和正交试验，对枳壳橙皮苷提取工艺参数进行优化。结果表明，枳壳橙皮苷最佳提取工艺参数为：乙醇浓度70%、料液比1∶6、提取时间3.5 h、提取温度65 ℃，提取次数2次，橙皮苷提取率为5.72%。该方法提取率较高，重复性好，工艺简单，适合工业化生产。

关键词：正交试验;提取工艺;枳壳;橙皮苷

枳壳为芸香科植物酸橙( L.)及其栽培变种的干燥未成熟果实，盛产于江西、福建、陕西等地，富含黄酮类、挥发油、生物碱及香豆素等多种生物活性物质，枳壳黄酮类物质主要包括柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷和川橙皮素等[1-3]。其中橙皮苷具有抗菌消炎、抗肿瘤、降血压、抗过敏、降低胆固醇及改变体内酶活性等广泛的药理作用[3-6]。因此，本研究以商洛枳壳为研究对象，采用醇-碱提酸沉淀法，通过单因素和正交试验，对枳壳中橙皮苷提取工艺进行优化，以期为商洛枳壳的应用扩展、经济价值的提升及实现枳壳经济产业化提供一定技术参考。

1　材料与方法

1.1　材料和试剂

商洛枳壳，采自商洛市;芦丁橙皮苷对照品，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司：无水乙醇，氢氧化钠，盐酸等均为分析纯，购于天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2　仪器与设备

HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂出品)、高速万能粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)、DHG-9132A电热恒温鼓风干燥箱(北京齐欣科学仪器有限公司)、H-2050R离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、755B紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司制造)。

1.3　试验设计

1.3.1　工艺流程

试验流程：枳壳→干燥粉碎→水浴提取→过滤→滤液→酸沉→离心→沉淀→干燥→定容→测吸光度。

1.3.2　操作要点

(1)干燥粉碎。将枳壳在50 ℃干燥恒重，粉碎成粉末状，每次称取10.0 g，加入锥形瓶中。

(2)水浴提取与过滤。向锥形瓶中加入不同浓度的pH为13的乙醇溶液，在恒温水浴锅中进行提取，分别控制时间t，温度T，然后静止冷却，过滤，弃去滤渣。

(3)酸沉。用2 mol/L HCl溶液调整滤液pH，直至pH为7，静置过夜。

(4)离心与干燥。将酸沉后的滤液用离心机在4 000 r/min，离心5 min，弃去上清液，取出沉淀，然后用无水乙醇清洗沉淀，直至清洗液无色，然后在70 ℃恒温干燥箱进行干燥，直至沉淀质量不再发生变化[7-8]。

(5)定容和测吸光度值。准确称取沉淀量为10 mg，用pH为13的碱性无水乙醇溶液完全溶解后，定容到100 mL的容量瓶中，在287 nm测定其吸光度值，并计算相应的橙皮苷提取率。

1.3.3　枳壳橙皮苷提取工艺优化

分别以乙醇浓度(50%、60%、70%、80%和90%)、料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8和1∶10)、提取时间(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)、提取温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、

80 ℃和90 ℃)、提取次数(1、2、3、4和5)为主要因素，pH为13的碱性乙醇为提取剂，研究各因素对枳壳橙皮苷提取效果的影响，并根据单因素实验结果进行正交试验。

1.3.4　标准曲线的绘制

精密称取橙皮苷标准品10 mg，用pH为13碱性无水乙醇完全溶解，定容100 mL，得到浓度为100 μg/mL橙皮苷标准溶液。吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和6.0 mL标准溶液于10 mL试管中，用碱性乙醇稀释到相应的刻度线，在287 nm波长下测定不同浓度标准品吸光度值，以标准品的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.5　橙皮苷提取率的计算

橙皮苷提取率为提取的橙皮苷的质量与原料的质量(干重)之比，则提取率可由计算公式获得。计算公式：

式中：E-橙皮苷提取率;C-样品浓度(μg/mL);N-样品稀释倍数;V-待测样液体积(mL);M-原料的质量(g)。

2　结果与分析

2.1　橙皮苷标准曲线

橙皮苷标准曲线如图1所示，得到回归方程：y=0.016 4x-0.002 5，R2相关系数2=0.999，橙皮苷浓度在10～60 μg/mL范围内浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

2.2　单因素试验结果分析

由图2知，随乙醇浓度的增大，橙皮苷提取率逐渐增加，当乙醇浓度为70%时，橙皮苷提取率达到最大。但继续增加乙醇浓度，橙皮苷提取率反而降低。这可能是由于随着乙醇浓度增大，不利于橙皮苷的溶出，从而使橙皮苷提取率下降。因此，确定乙醇浓度为70%。

由图3可看出，随料液比的增大，橙皮苷提取率逐渐增加，当料液为1∶6时，橙皮苷提取率达到最大。但继续增加料液比，橙皮苷提取率反而降低。这可能是当料液比较小时，橙皮苷不能充分溶解，橙皮苷提取率较低，料液比过大时，相同温度条件下需加热更多液体，所以细胞内部升温缓慢，导致橙皮苷溶出缓慢，提取率降低。因此，确定料液比为1∶6。

由图4可看出，随提取时间的延长，橙皮苷提取率逐渐增大，当提取时间为3 h时，橙皮苷提取率最大。但继续延长提取时间，橙皮苷提取率反而下降。这可能是因为提取

3 h时橙皮苷已充分溶解于溶剂中，当提取时间超过3 h，导致枳壳中其他醇溶性强、亲脂性强的杂质成分溶出，同时部分橙皮苷分解，导致橙皮苷提取率下降。因此，确定橙皮苷提取时间为3 h。

由图5可看出，随提取温度升高，橙皮苷提取率逐渐增加，当提取温度70 ℃时，橙皮苷提取率达到最大。但继续升高温度，橙皮苷提取率逐渐下降。可能提取温度过高导致橙皮苷变性，胶状物质增加，同时，提取温度过高，导致溶剂蒸发过快，且温度继续升高，成品颜色发黑，溶出的非橙皮苷成分增多，导致橙皮苷的提取率下降。因此确定提取温度为70 ℃。

由图6可看出，随着提取次数的增加，橙皮苷提取率逐渐增加。但采用二次提取法提取效果增幅相对较高，之后增加提取次数，橙皮苷提取率变化并不明显，综合考虑提取时间和经济因素，确定提取次数为2次。

2.3　正交试验结果分析

由单因素试验结果得出乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)4个因素对橙皮苷提取率影响较大，因此采用正交试验设计法得出的正交因素及水平如表1所示。由表2中正交试验结果极差分析得出，对橙皮苷提取率影响顺序依次为A(乙醇浓度)>B(料液比)>C(提取时间)>D(提取温度)，因素提取温度对橙皮苷提取率影响较小，且验证试验结果表明提取工艺为2232，平均提取率为5.76%，因此从经济成本考虑，选择水平1，最终确定最佳提取工艺组合为：2231，即乙醇浓度为70%，料液比为1∶6，提取时间为3.5 h，提取温度为65 ℃，橙皮苷提取率为5.72%。

3　结论

本研究以商洛枳壳为原料，通过单因素试验和正交试验，优化得到橙皮苷最佳提取工艺参数：乙醇浓度为70%、料液比为1∶6、提取时间为3.5 h、提取温度为65 ℃，采用二次提取法，橙皮苷提取率为5.72%，该方法提取工艺简单，重复性好，工艺稳定。

醇-碱提酸沉淀法主要是利用橙皮苷在碱性条件开环溶解进行提取，在酸性条件下闭环形成沉淀。本研究通过单因素和正交试验，对枳壳中橙皮苷提取工艺做了初步研究，较成功地提取得到了橙皮苷。本试验采用乙醇的碱性溶液进行提取，不但环保、节能，而且提取率相对较高，适合工业生产。研究结果表明商洛枳壳中含有丰富的橙皮苷生物活性物质，具有广阔的开发利用前景和价值。

参考文献

[1]田芳,何小芳,谭梓君,等.枳壳HPLC特征图谱及6个黄酮苷类成分含量测定[J].药物分析杂志,2020,40(6):

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[2]龚斌,李琴,胡小红,等.枳壳化学成分及药理作用研究进展[J].南方林业科学,2019,47(3):40-45.

[3]李陈雪,杨玉赫,冷德生,等.枳壳化学成分及药理作用研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2019,21(2):158-161.

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[5]龚斌,李琴,胡小红,等.枳壳化学成分及药理作用研究进展[J].南方林业科学,2019,47(3):40-45.

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[7]王灵果.柑橘果皮中橙皮苷提取与精制工艺研究[D].石家庄:河北科技大学,2013.

[8]单飞狮,张东钫,杨敏,等.乙醇-碱液回流法提取红橘果皮中橙皮苷工艺研究[J].绵阳师范学院学报,2018,37(2):

66-71.

基金项目：保健食品开发研究团队(18SCX005)。

作者简介：任嘉瑜(1992—)，女，陕西商洛人，硕士，助教。研究方向：食品安全与加工。

通信作者：范娜(1986—)，女，陕西佛坪人，博士，讲师。研究方向：功能性食品开发及食品营养学。E-mail: 。