孙小杰，王玉梅，刘 真，姜 星

(南京市食品药品监督检验院，江苏南京 211198)

摘 要：目的：建立免疫亲和柱-液质联用法测定饼干中赭曲霉毒素A的分析方法。方法：样品经80%甲醇水溶液提取，提取液经免疫亲和柱净化，并联合液质联用法对饼干中的赭曲霉毒素A进行测定。结果：赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL范围内呈良好的线性关系，线性相关系数大于0.99，方法的定量限为1.0 µg/kg。样品的加标回收率为89.61%～105.7%，测定结果的相对标准偏差均小于7.26%(=6)。结论：该方法具有快速，定量准确，线性相关性理想，可适用于饼干中赭曲霉毒素A的测定。

关键词：液质联用;免疫亲和柱;赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素是真菌毒素之一，是由纯绿青霉、赭曲霉及碳黑曲霉等产毒菌株污染粮食、食品、饲料及其他农副产品后所产生的一种有毒代谢产物，有A、B、C、D4种化合物，其中毒性最大的是赭曲霉毒素A[1]。赭曲霉毒素A对动物和人的毒性主要有肾脏毒、肝毒、致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用[2]。为了保障人们的身体健康，《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)规定了谷物及其制品中赭曲霉毒素A的限量为5.0 µg/kg[3]。

2021年4月，食品和快速预警系统通报出口至我国的薄脆饼干中赭曲霉毒素A含量不合格，目前文献报道的赭曲霉毒素A的测定方法主要涉及粮食及其制品、咖啡、酒[4-6]，针对饼干中赭曲霉毒素A测定技术的研究较少。因此有必要建立饼干中赭曲霉毒素A的方法，为饼干中赭曲霉毒素A的含量测定提供技术支撑。

1　试验部分

1.1　主要仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：Agilent 1260 HPLC-6470型，配有电喷雾离子源，美国 Agilent公司;电子天平：XS205型，瑞士Metler-Toledo公司;固相萃取装置：Wat200609，美国Waters公司;免疫亲和柱：3 mL,青岛普瑞邦生物工程有限公司;氮吹仪：N-EVAP，美国Organomation公司;离心机：ROTINA 35，德国Hettich公司。

甲醇、乙腈、甲酸：色谱纯，美国ROE公司;甲酸铵、冰乙酸、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钾、氯化钾、吐温20：分析纯，国药集团化学试剂有限公司;赭曲霉毒素标准物质：上海安谱实验科技股份有限公司;实验室用水为经Mili-Q净化系统(0.22 µm过滤膜)过滤的超纯水;真菌毒素清洗缓冲液：先将12.5 g氯化钠、2.5 g碳酸氢钠溶于约250 mL水中，加入0.05 mL吐温20，用水定容至500 mL;磷酸盐缓冲液：先将4.0 g氯化钠、0.6 g磷酸氢钠、0.1 g磷酸二氢钾、0.1 g氯化钾溶于约490 mL水中，用浓盐酸调节pH至7.0，用水定容至500 mL。

1.2　标准溶液的配制

(1)赭曲霉毒素A标准储备液。称取赭曲霉毒素A标准品1.0 mg，用乙腈-甲醇溶液(50+50)溶解并定容至100 mL，配成10 µg/mL的标准储备液，-20 ℃保存。

(2)赭曲霉毒素A标准工作液。准确移取一定量的赭曲霉毒素A标准储备液，用空白样品提取液稀释，分别配成0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL和20 ng/mL的基质标准工作溶液，4 ℃保存。

1.3　色谱-质谱条件

色谱柱：Eclipse plus-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，3.5 µm，美国agilent公司);柱温30 ℃;流速：0.2 mL/min;进样量：20 µL;流动相：A为5 mmol/L甲酸铵水溶液(含有0.1%甲酸)，B为95%乙腈水溶液(含有0.1%甲酸);梯度洗脱程序为：0～2 min，35%～95% B;2～7 min，95% B;7～7.1 min，95%～35% B;7.1～12min，35% B。

1.4　样品处理

1.4.1　样品提取

称取粉碎均匀的试样25.0 g，加入100 mL甲醇-水溶液(80+20)，高速均质5 min后用定量滤纸过滤，准确移取4 mL滤液于离心管中，加入26 mL磷酸盐缓冲液后混匀，混合液备用。

1.4.2　样品净化

将免疫亲和柱连接于20 mL玻璃注射器下，将混合液分两次注入玻璃注射器中。调节流速约1 滴/s，直至空气进入亲和柱中，依次用真菌毒素清洗缓冲液10 mL、水10 mL连续淋洗亲和柱，调节流速1～2 滴/s，弃去全部流出液，抽干亲和柱。加入1.5 mL甲醇，调节流速约为1 滴/s，用试管收集全部洗脱液，在45 ℃下水浴，氮气吹干，用500 µL

流动相溶解，供检测用。

2　结果与讨论

2.1　提取溶剂的选择

以甲醇-水溶液(80+20)与乙腈-水溶液(60+40)作为提取溶剂，结果发现两种提取溶剂的回收率都能达到90%以上，但考虑到乙腈的毒性，选择甲醇-水溶液(80+20)作为提取溶剂。

2.2　基质效应、线性方程与定量限

采用基质标准溶液曲线与溶剂标准溶液曲线的斜率比来评价基质效应，斜率比为11.9，饼干基质对赭曲霉毒素A具有基质增强效应，因此采用基质标准溶液对赭曲霉毒素A进行定量分析。赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL浓度范围内，标准溶液的质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系(r≥0.992 3)，线性方程为y=7 166.18x-474.81，以信噪比为S/N≥10时确定定量限为1.0 µg/kg，欧盟规定饼干中赭曲霉毒素A限量值为3.0 µg/kg，因此，方法定量限满足检测的需求。

2.3　方法回收率与精密度试验

通过向阴性样品中添加1.0 µg/kg、3.0 µg/kg、10.0 µg/kg3个浓度水平的赭曲霉毒素A标准溶液，进行方法回收率和精密度试验，测定结果见表1。由表1可知，赭曲霉毒素A的回收率在89.61%～105.7%，相对标准偏差为3.69%～7.26%，符合GB/T 27404—2008中检测方法确认的要求。

3　结论

对饼干进行前处理，然后采用液质联用法对赭曲霉毒素A进行测定，从而建立了饼干中赭曲霉毒素A测定的检测方法。本方法简便准确，实用性强，可为饼干中赭曲霉毒素A风险监测提供可靠的技术支持。

参考文献

[1]PETZINGER E,ZIEGLER K.Ochratoxin A from a toxicological perspective[J].Journal of Veterinary Pharmacology Therapeutics,2010,23(2):91−98.

[2]REDDY L,BHOOLA K.Ochratoxins-food contaminants: impact on human health[J].Toxins,2010,2(4):771-779.

[3]国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量:GB 2761—2017[S].北京:中国标准出版社,2017.

[4]吕相征,谢妮,李业鹏,等.用高效液相色谱法测定粮食样品中的赭曲霉毒素A[J].中国医科大学学报,2002(4):47-48.

[5]樊祥,禇庆华,周瑶,等.液-液萃取结合免疫亲和柱层析净化-高效液相色谱测定烘焙咖啡中赭曲霉毒素A[J].理化检验(化学分册),2008(8):736-739.

[6]杨超,林洪,张辉珍,等.免疫亲合柱净化高效液相色谱检测啤酒中赭曲霉毒素A[J].食品与发酵工业,2007(12):127-129.