板栗壳黄酮类成分的提取工艺研究

　　

　　张琳琳 1，吕华瑛'，王 琳 1，石 亮2，李克明3

　　

　　（1.山东中医药高等专科学校，山东烟台 264199;2.山东药品食品职业学院，山东威海 264210;

　　

　　3.山东省中医药研究院，山东济南 250014）

  基金项目∶山东省中医药科技发展计划项目（2015-218）。 

　　

　　摘要∶为了优化板栗壳中的黄酮类成分的提取工艺。分别采用不同溶剂、不同提取方式浸提板栗壳中的黄酮成分，并选取提取次数、加醇量（料液比）、提取时间、醇浓度作为考察因素，设计正交实验对提取工艺进行优化，以芦丁为标准品，硝酸铝-亚硝酸钠比色法，用可见-紫外分光光度计检测提取物中总黄酮的含量，比较总黄酮提取物的收得率，优选最佳提取工艺。结果表明，当选用60乙醇回流提取，提取2次，加醇量为10倍量，提取时间1.5h时板栗壳总黄酮提取率最高，平均提取率为19. 36%.

　　

　　关键词∶板栗壳;黄酮;提取工艺

　　

　　板栗壳为壳斗科植物板栗（Castanea mollissima Bl.）的干 燥外果皮，除青海、新疆以外，在辽宁以南各省（市、区）均 有栽培，作为中药收载于《中华人民共和国药典四部》（2015 年版）中[1],其药性甘、涩、平，具有降逆化痰、清热散结、 止血之功效，常用于治疗反胃、消渴、咳痰、療痂、鈕血、 便血及腮腺炎等。

　　

　　板栗壳为板栗的带刺毛壳，即板栗总苞。历代"本草” 对其称呼不同，《证类本草》中称其为“栗毛壳”，《滇南 本草》中称其为“子上壳刺”，《本草纲目》《中华本草》《中 药大辞典》中均称其为"栗毛球”，江西《草药手册》中称其 为“板栗壳斗"，《中国药典》中称其为"板栗壳”，至今, 各名称均有不同程度沿用。

　　

　　近年研究表明，板栗壳含有丰富的黄酮、多糖、酚类等 成分PF,文献报道栗壳中含有丰富的天然棕色素，属于黄 酮类，不仅可广泛用于食品、日用化学品和药品的着色剂， 现代药理研究还显示栗壳黄酮具有抗菌、抗氧化、自由基清 除等多方面作用故本课题系统研究并优化板栗壳中黄 酮类成分的提取工艺，为其工业化规模生产提供依据。

　　

　　1仪器与试剂

　　

　　板栗，济南市售。

　　

　　电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；FA2004分析 天平（上海第二分析仪器厂）；TU-1810紫外分光光度计 （北京普析通用仪器有限公司）；KQE-400B型超声清洗机 （济南巴克超声波科技有限公司）；KFS-C2电子天平（凯丰 集团）。

　　

　　无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、芦丁标准品。

　　

　　2方法与结果

　　

　　2.1黄酮成分测定

　　

　　釆用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品绘制标准 曲线。准确吸取芦丁标准溶液0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、 1.00 mL、1.50 tnL 和 2.00 mL（相当于芦丁 0 ng、75 ng、 150昭、300昭、450 jig和600 gg）,加蒸馅水补足至2 mL,各加入30%乙醇溶液4 mL和5%亚硝酸钠溶液0.5 mL, 振摇后放置5 min,加入10%硝酸铝溶液0.5 mL,摇匀后 放置6 min,加l.Omol/L氢氧化钠溶液4 mL,摇匀，放置 15 min,于510 nm波长处测定吸光度，以零管为空白， 以吸光度S为纵坐标、芦丁含量CCgg/mL）为横坐标绘制 标准曲线，得到曲线方程为S11.67C-0.016 6,相关系数 居=0.999 1,芦丁溶液的浓度在0.017〜0.104 ng/mL范围内 与吸光度呈良好的线性关系。

　　

　　样品测定。取2 mL样品按照标准曲线绘制的操作步骤 进行检测，同样于510nm处进行吸光度的测定。

　　

　　2.2工艺流程

　　

　　将板栗壳洗净后放于60 P烘箱中烘干，粉碎，过40目 筛，精密称取栗壳粉样品2 g,加入一定体积的溶剂，在相 应温度水浴和浸提时间内浸提，浸提液经5 000 r/min离心 15 min,取上清液，定容至40 mL,放置于4 P冰箱中贮存 备用。

　　

　　2.3不同溶剂浸提产率

　　

　　分别釆用水、75%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯为溶剂浸提 板栗壳中的黄酮成分，将提取成分纯化后用超纯水定容至 100 mL作为供试品试液，按照2.1的方法，测定吸光度， 根据标准曲线的回归方程得出不同浸提液中黄酮的浓度，根 据公式（1）计算黄酮得率。

　　

　　式（1）中，归为总黄酮产率，%, C为测定总黄酮的浓 度，mg/tnL, D为稀释倍数，「为供试液的体积，mL, M 为板栗壳的质量，go

　　

　　不同溶剂浸提板栗壳总黄酮产率见表1。从表1可以看 出，乙醇作为溶剂提取黄酮的产率最髙。

　　

　　2.4不同浓度乙醇提取黄酮产率

　　

　　精确称取板栗壳粉样品2.00 g共18份，置于100 mL具塞 锥形瓶中，分别加入25 mL 35%, 45%、55%、65%、75%和85%的乙醇溶液，每个处理重复3次。各组样品均在室温下浸 泡24h,之后减压、抽滤，滤液瞄于旋转蒸发仪上减压蒸干, 温度控制在60 °C以下。将蒸干的样品称重，干浸膏用30%乙 醇超声溶解，转移至10 mL容量瓶中，并用30%乙醇定容至 刻度，摇匀后测定，按公式(1)计算黄酮产率。实验结果见表2, 从表2可以看出，55%乙醇提取的黄酮产率最高。

　　

　　2.5不同提取方法提取黄酮产率

　　

　　(1)回流提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00 g,置于 250 mL平底烧瓶中，加入25.0 mL的55%乙醇溶液，浸泡 20 min后加热回流提取30 min,放冷，减压抽滤，滤液放 置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在60。(2以下，干浸 膏用30%乙醇超声溶解，转移至25 mL容量瓶中，用30% 乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。平行测定4份，计 算平均产率。

　　

　　(2)超声提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00g,置 于100 mL具塞锥形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡 20 min后在超声波清洗仪上室温超声30 min,超声完毕后减 压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在 60 °C以下，向干浸膏中加入适量30%乙醇超声溶解，转移至 25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。 平行测定4份，计算平均产率。

　　

　　(3)微波辅助提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00 g, 置于250 mL具塞锥形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸 泡55 min(保证样品与浸提溶剂接触的总时间与其他方法一 致)，再用微波中火提取5 min(提取中每隔1〜2 min停30 s), 放冷，减压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温 度控制在60 P以下，干浸膏用30%乙醇超声溶解，转移至 25 ml量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产 率。平行测定4份，计算平均产率。

　　

　　实验结果见表3,由表3可以看出，55%乙醇回流提取 的黄酮产率最高。

　　

　　2.6正交设计

　　

　　影响板栗壳总黄酮含量的因素主要有提取次数、加醇量 (倍量)、提取时间、醇浓度,故以这4个影响因素的3个水平,

　　

　　釆用L9 (3，)正交表设计进行实验，考察板栗壳中总黄酮的 含量，结果见表4和表5。

　　

　　由表5的正交试验数据结果可以看出，影响总黄酮含量 提取的4个因素按顺序为D>B>C>A，即提取醇浓度 >加醇量〉提取时间〉提取次数。通过4因素3水平的考察, 得出最佳提取条件为AB3C3D3,即提取1次，加醇量为10 倍量，提取时间L5h,提取醇浓度60%时，所得板栗壳总 黄酮含量最高，为19.21%。通过方差分析表6可见，因素D、 B、C对试验结果有显著性影响，综合分析实验条件后选择 A2B3C3D3为最佳提取条件，即釆用60%醇提取法，提取2次, 加醇量为10倍量，提取时间1.5 h。在以上工艺优选条件下 重复实验3次，平均提取率为19.36%。

　　

　　3讨论

　　

　　板栗营养价值丰富，口感美味，受到广大人民的喜爱， 在全国栽培广泛，但板栗壳目前大多被当作废弃物丢弃，造成了资源的浪费，主要原因是人们并未意识到板栗壳的价值 所在，对板栗壳的开发利用也未普及推广。党的十八大提出 了建设环境友好型、资源节约型社会的要求，加强板栗壳的 开发利用也正是响应国家号召的一大举措。

　　

　　本文通过前期对板栗壳的药理作用的文献査阅，发现越 来越多的科研人员开始重视板栗壳的重大开发价值，对板栗 壳的研究也越来越多，通过研究人们发现了板栗壳具有的许 多药理作用，包括抗菌抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖降血 脂和改善脑缺血等人们非常关注的一些作用，当然具体的临 床应用还需要进一步的研究。

　　

　　在本实验研究中通过对不同溶剂浸提板栗壳中的黄酮 成分，比较总黄酮提取物的收得率，优选最佳提取溶剂为 55%乙醇提取；通过不同提取方式的研究确定了最佳提取方 式为55%乙醇回流提取；通过对影响实验的4个因素3个 水平的正交试验最终确定了最佳提取工艺为选用60%的乙 醇回流提取，加醇量为10倍量，提取次数为2次，提取时 间为1.5h,此时板栗壳总黄酮提取率最高，为19.36%。本

　　

　　陆俊,赵安琪，成策，等.核桃营养成分与生理活性及 开发研究为工业化规模生产及促进栗壳的临床药用提供了理论 依据。

　　

　　参考文献

　　

　　[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典四部[M],北京： 中国医药科技出版社,2015.

　　

　　[2]刘义庆.板栗壳中黄酮类生物活性成分的提取与微乳 薄层分离分析[J].江汉大学学报(自然科学版),2008,36(4):33-35.

　　

　　[3]冉靓，武子敬，冉阳，等.大孔吸附树脂纯化板栗壳总 黄酮的研究[J],安徽农业科学2013,41(2):827-829.

　　

　　[4]何珊珊.板栗壳的化学成分研究[D],成都:西南交通 大学,2015.

　　

　　[5]李云雁，宋光森.板栗壳色素抗氧化性研究[J],中国油 脂,2004(5):4648.

　　

　　[6]刘平，李云雁，罗渊，等.板栗壳棕色素对活性氧自由 基的清除作用[J].食品科技2008(2):175-178.

　　

　　[7]石恩慧，郭凯军，李红，等.板栗总苞多酚■提取工艺优 化及其抗氧化性研究[J].动物营养学报,2013,25⑵:406414.