饲料中β-受体激动剂检测方法前

　　

　　处理方式改进研究

　　

　　王 楠，安晨亮，安阳丽，常瑞雪*

　　

　　（河北玖辛检测技术服务有限公司，河北保定07100）

　　

　　作者简介∶王楠（1987—），女，河北保定人，硕士，工程师。研究方向∶食品质量与安全。

　　

　　通信作者∶常瑞雪（1981—），女，河北保定人，硕士，工程师。研究方向∶化学分析检测。E-mail∶23354986（@qg.com。

　　

　　摘 要∶现行农业部1063号公告-6—2008，农业部1629号公告-1-2011，NY/T 3145—2017等检测标准都是使用外标法对饲料中的 β-受体激动剂进行检测，而外标法在检测饲料中 β-受体激动剂时所测数值有一定的误差。基于此，课题组应用内标法对 β-受体激动剂进行测试。 内标法的优点是结果更准确，可以消除操作条件等变化引起的误差。对饲料中的 β-受体激动剂提取液进行优化，克服了原提取液中盐酸易挥发且腐蚀性强的缺点。

　　

　　关键词∶饲料;β-受体激动剂;液相色谱质谱联用法;内标法;提取液优化

　　

　　近年来，随着生活水平的提高，我国居民的饮食习惯转 向追求饮食的健康均衡，因此脂肪含量较低的瘦肉获得更多 青睐。但是国内外频发的食品污染和中毒事件，使食品安全 问题成为消费者、政府等关注的焦点问题。其中片受体激 动剂的残留一直是肉制品安全的难题，它不仅影响我国的畜 牧产品的出口贸易，还威胁着消费者的健康，因此该类药物 逐渐被禁止用于畜禽生产[1]=

　　

　　片受体激动剂闵是肾上腺素类"激动剂"兴奋剂等 一类药物的统称，当以超过治疗剂量5-10倍的用量用于家 畜饲养时，会干扰胰岛素的释放，加快体内糖原和脂肪的 分解叫从而能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转 化率，带来更多经济价值。但它对人体有很危险的副作用， 对于患有高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病的人影 响和危害更大，严重者可危及生命四。中国农业部1997年 发文禁止瘦肉精在饲料和畜牧生产中使用，2001年12月27 日、2002年2月9日、4月9日，农业部分别下发文件禁止 使用阡受体激动剂类药物作为饲料添加剂。尽管国家针对 瘦肉精问题明令禁止，但是在利益的驱动下，片受体激动 剂仍被大量非法用于畜牧生产闵，动物性食品中因而出现了 不同程度的药物残留。阡受体激动剂残留问题导致了许多 食物中毒事件，所以需要从源头抓起，做好饲料中"瘦肉精” （片受体激动剂）的检测，杜绝瘦肉精在养殖过程中的使用， 从根本上杜绝该类添加剂的有害残留。

　　

　　P-受体激动剂在食品中残留会对人体产生危害，对其准确、 快速地检测非常重要，从国家到地方aw都非常重视。现行农 业部1063号公告-6—2008、农业部1629号公告T—2011、 NY/T3145—2017等检测标准都是使用外标法对饲料中的片受 体激动剂进行检测，由于在饲料中提取P■受体激动剂存在一 定的缺陷，所以外标法所测数值有一定的误差。针对这个问题 本课题组应用内标法对P-受体激动剂进行测试，内标法的优 点是结果更准确，可以消除操作条件等变化引起的误差。

　　

　　1材料与方法

　　

　　1.1材料与试剂

　　

　　甲醇、甲酸均为色谱纯；浓盐酸、磷酸、醋酸、三氟乙 酸、氨水和醋酸铅均为分析纯；MCX混合型阳离子交换柱 （60 mg/3 mL）；标准物质沙丁胺醇，购自中国食品药品检 定研究院；莱克多巴胺、、盐酸克伦特罗、同位素内标物莱 克多巴胺-D9和沙丁胺醇-D3,均购自北京坛墨质检科技 有限公司，纯度均N98%；实验用水由纯水仪制备，德国 赛多利斯Sartorius公司。

　　

　　1.2仪器与设备

　　

　　液相色谱-串联质谱仪由1100液相色谱仪（安捷伦科 技有限公司）API 4000三重四级杆串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）组成，其他仪器设备包括TD10002C电子天平、 RE-52A旋转蒸发器,QL-901旋涡混合器、水浴恒温振荡器、 超低温离心机、CM-12氮吹仪和SPE-24固相萃取装置。

　　

　　1.3标准溶液配制

　　

　　1.3.1外标法标准溶液的配制

　　

　　标准物质选取了莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇，用 甲醇配制成1 Hg-mL'1的混标储备液，避光冷藏保存。

　　

　　1.3.2内标法标准溶液的配制

　　

　　内标物选取了莱克多巴胺-D9、沙丁胺醇-D3,用甲醇 配制成100 ng/mL的混标储备液，避光冷藏保存。

　　

　　1.4方法

　　

　　1.4.1提取液

　　

　　配制了 4种不同提取液，分别为盐酸-甲醇提取液、磷 酸-甲醇提取液、醋酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提 取液，分别取0.1mol/L盐酸、磷酸、醋酸和三氟乙酸溶液 80 mL,再分别加入甲醇20 mL混匀。

　　

　　1.4.2提取方法

　　

　　分别称取2 g左右粉碎过筛好的饲料样品，于50 mL离 心管中，准确加入19 mL提取液和1 mL饱和醋酸铅溶液，涡旋混合30 s,超声提取10 min,再涡旋混合30 s,超声提 取10 min,然后于8 000 r/min离心10 min,取上清液备用。

　　

　　1.4.3净化

　　

　　先将MCX固相萃取小柱，依次用3 mL甲醇、3 mL 水活化，取上清液5 mL过柱，用2 mL水和2 mL甲醇依次淋洗，空气抽干2 min,用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脱,收集洗脱液，旋转蒸发(40。《至干,用1.0 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，过0.22卩m有机滤膜后， 待上机测定。

　　

　　1.4.4色谱条件

　　

　　色谱柱：C18柱, 150 mmx2.1 mm,粒度 3.5 pm(2020-

　　

　　SPZ-07-01),柱温40 °C,进样体积：5pL,流动相A：甲醇，

　　

　　流动相B： 0.2%甲酸水溶液，流速：0.3mL/min,梯度洗脱程序见表1。

　　
　　1.4.5质谱条件

　　

　　扫描方式：正离子扫描；监测方式: MRM多反应监测，

　　

　　MRM参数见表2； 喷雾电压：5 500V； 气体温度：550 °C o

　　2结果与分析

　　

　　2.1内外标法的优化

　　

　　称取2g左右空白饲料样品，分为两组，一组加入 lOgg/kg莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇的标准物质混合 液，另一组加入等量标准物质混合液后，再加入等量的莱克 多巴胺-D9、沙丁胺醇-D3混标储备液。加标后釆用盐酸- 甲醇提取液的方式进行前处理，设置空白对照，测定3种 阡受体激动剂的回收率和精密度。从表3中可以看出，外 标法测定的回收率为77.0%、77.2%、77.5%,内标法测定的 回收率为102.5%、103.2%、100.2%=结果表明，内标法的 回收率较外标法有显著提高，精密度良好，检测结果更接近 于真值。

　　

　　2.2提取方法的优化

　　

　　称取2 g左右空白饲料样品分为4组，均加入等量内标 混标储备液和10 ng/kg外标混标储备液，即釆用内标法， 加标后分别加入4种不同的提取液，即盐酸-甲醇提取液、 磷酸-甲醇提取液、醋酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇 提取液，按照上述的前处理方式进行处理，同时设置空白 对照，测定4种不同提取液处理后的片受体激动剂的回收 率和精密度。从表4中可以看出，盐酸-甲醇提取液处理 后的回收率为99.5%、99.4%、98.1%,磷酸-甲醇提取液回 收率为82.8%、82.8%、96.2%,醋酸-甲醇提取液回收率 为90.5%、87.0%、98.5%,三氟乙酸-甲醇提取液回收率 为82.9%、81.0%、94.8%。浓盐酸-甲醇提取液的回收率最 好，但浓盐酸易挥发，且腐蚀性强；醋酸-甲醇提取液的回 收率稍逊于盐酸-甲醇提取液，但相对挥发性小，没有腐蚀 性，较安全；磷酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液的 回收率相对较低，因此最终选择醋酸-甲醇作为提取饲料中 P-受体激动剂的提取液。

　　

　　3结论

　　

　　实验结果表明，内标法的回收率较外标法有显著提高， 精密度良好，检测结果更接近于真值。设计不同的提取液对 饲料中的片受体激动剂进行提取，结果表明，浓盐酸-甲 醇提取液的回收率最好，但浓盐酸易挥发，且腐蚀性强；醋 酸-甲醇提取液的回收率稍逊于盐酸-甲醇提取液，但相对 挥发性小，没有腐蚀性，较安全；磷酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液的回收率相对较低，最终选择醋酸-甲醇 作为提取饲料中P-受体激动剂的提取液。虽然我国在食品 安全领域逐渐加大了监管力度，并建立了数量众多的各级食 品检测中心，但阡受体激动剂作为廉价的促进动物生长剂 仍有不法分子会使用，所以有必要继续开发灵敏度高、检测 速度快、准确度高的检测方法。

　　

　　参考文献

　　

　　[1]SHAO B,JIA X EZHANG J,et aLMulti-residual analysis of 16 p-agonists in pig liver; kidney and muscle by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry [J] .Food Chemistry 2009,114(3):1115-1121.

　　

　　[2]LIU R,LIU L Q,SONG S S,et al.Development of an immunochromatographic strip for the rapid detection of 10 P-agonists based on an ultrasensitive monoclonal antibody [J] .Food and A gricultural Immunology,2017,28(4):1-14.

　　

　　[3]王培龙受体激动剂及其检测技术研究[J],农产品质 量与安全,2014(1)： 44-52.

　　

　　[4]刘敏，刘戎，王立琦，等,猪肝中P-受体激动剂多残留 的样品前处理方法比较及同时检测[J].分析测试学报2012, 31(3)： 290-295.

　　

　　[5]顾亮，丁磊.液相色谱串联质谱法测定饲料中盐酸克 伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A[J].化学分析计 量,201221(1)：37.39.