超高效液相色谱一串联质谱法检测食品中15种

　　

　　真菌毒素含量

　　

　　邓新煜1，张健希'2，张京华1

　　

　　（1.辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳 110026;2.盘锦市检验检测中心，辽宁盘锦 124000）

　　

　　摘 要∶目的∶建立超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem MassSpectrometry，UPLC-MS/MS）同时测定食品中 15种真菌毒素的方法。方法∶ 样品经 50乙腈水溶液提取后，MycoSpinTM400净化柱净化，同位素内标稀释后，上机测定。 结果∶ 在低、中和高水平下，这15种真菌毒素的平均回收率为68.87～109.24??精密度在1.97??12.88??15种真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好，线性系数均大于0.995，检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分别为0.6～ 8.0 μg/kg和1.8～24.0 μg/kg。对生产日期为 2019—2020年的多种类粮油食品进行15种真菌毒素的检测工作，结果显示黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的阳性检出率最高。结论该方法灵敏度高、结果准确可靠，适合于食品中多种真菌毒素的同时快速检测。

　　

　　关键词∶超高效液相色谱 - 串联质谱法;食品;真菌毒素

　　

　　真菌毒素是食物或饲料中生长的真菌产生的代谢产物， 对人类和动物有害。早在11世纪就出现过真菌毒素中毒事 件，麦角菌核中的生物碱是造成中毒的主要原因，因此该病 被称为麦角菌病。麦角急性中毒的症状是产生幻觉和肌肉痉 挛，引起四肢动脉持续收缩和坏死。食用发霉的谷物制成的 面包会引发恶心、呕吐等症状。真菌毒素具有高度污染、剧 毒、稳定的理化性质，在食品加工，运输以及储存过程中已 存在很长时间，很难破坏。其通过受污染的食物以及饲料直 接进入人体以及动物体，或通过动物产品间接进入食物链， 在人类以及动物体内长期积累可导致神经毒性、致畸性、致 肾毒性、致癌性、致突变性以及致细胞毒性。

　　

　　根据污染的普遍度及毒性危害严重性分析，黄曲霉毒素 B]、伏马毒素B]、玉米赤霉烯酮及脱氧雪腐镰刀菌烯醇是 真菌毒素中具有剧毒且致癌的化学物质，也是近5年国家食 品安全监督抽检中重点监测的检验项目。

　　

　　传统的霉菌毒素检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、 酶联免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)等。这些方 法一般只能针对一种或一类结构类似的毒素进行快速筛选、 定性或定量检测[11«薄层色谱法简捷、便利，但重现性差、 精密度低；酶联免疫法特异性强、前处理简单，但假阳性率 高，不能作为确证方法；气质联用法需要衍生化前处理、操 作费时费力図。与其他真菌毒素检测方法相比，液相色谱- 串联质谱法，集高效分离和多组分定性与定量检测于一体， 成为近年来霉菌毒素多残留检测技术的主流方向。

　　

　　本研究利用Mycospin ™ 400前处理技术加上同 位素内标技术，建立了超高效液相色谱-串联质谱法 (Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry, UPLC-MS/MS)同时测定花生、玉米、大豆 油等粮油食品中的15种真菌毒素的分析方法，为痕量多种 真菌毒素和代谢物的同时检测提供了一个方便、快速、高效、 低成本、高通量、标准化的环境友好型检测技术手段。

　　

　　1材料与方法

　　

　　1.1仪器与材料

　　

　　美国AB SCIEX 4000Q超髙效液相色谱-串联质谱仪 (美国Agilent公司)；Milli-Q超纯水仪(德国默克密理 博公司)；Picol7微量离心机(美国赛默飞世尔公司)； BP211D分析天平(德国赛多利斯公司)；MM400型混合 研磨仪(德国RETSCH GmbH)o

　　

　　甲醇、乙睛、乙酸、醋酸：色谱纯，德国Merck公司； 15种真菌毒素 黄曲霉毒素Bi(AFBD、黄曲霉毒素B2(AFB2), 黄曲霉毒素G (AFGi)、黄曲霉毒素G2 (AFG2)、伏马菌 素Bi (FBD、伏马菌素B2 (FB2)、伏马菌素B3 (FB3)、 呕吐毒素(DON)、15-乙酰基呕吐毒素(15-ACDON)、 3-乙酰基呕吐毒素(3-ACDON)、T2毒素(T-2)、HT2毒 素(HT-2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA)、 雪腐镰刀菌烯醇(NIV)。黄曲霉毒素混标包含Bi、GP浓度 为2ng/mL和Bz、G2,浓度为0.5 ng/mL；伏马毒素混标包含 伏马毒素Bi、伏马毒素B2和伏马毒素B3,浓度均为50 ng/mL； 呕吐毒素、镰刀菌烯酮、15-乙酰基呕吐毒素、3-乙酰基呕 吐毒素、T2毒素、HT2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A 浓度均为10 ng/mL,以及6种同位素内标U-LGJ-伏马毒 素Bi (25 ng/mL)、U-F%]-伏马毒素B?、U-性打-伏马 毒素 B3 浓度为 10 ng/mL、U-[13Cj5]-呕吐毒素(25 ng/mL)、 U-[13C18]-玉米赤霉烯酮浓度为25飓/mL、U-f13^]-赭曲 霉毒素A浓度为10 jig/mL(奥地利ROMER LABS公司)； MycoSpin ™ 400多功能净化柱(奥地利ROMER LABS公司)。 1.2实验方法

　　

　　1.2.1标准溶液的配制

　　

　　分别配制正离子标准曲线和负离子标准曲线，75pL不 同浓度混标加上75皿同位素内标混标混合后进样，正、负 离子浓度如表1、表2所示印。标准曲线现配现用，如未能 及时使用，在-20 °C冰箱最多保存1周。

　　

　　1.2.2样品前处理

　　

　　称取试样(25±0.1) g至250mL三角瓶中，加入100 mL 50%乙腊水溶液，于摇床上(250 r/mim)振摇90 min, 过滤上清液。取10 mL滤液至试管，同时加入500 gL 乙酸涡旋振荡，混匀后从试管中取750皿样液加入 MycoSpin ™ 400多功能净化柱中，盖上盖子涡旋振荡 1 min,待样液的颜色变成浅蓝色，折断MycoSpin™400多 功能净化柱下端封口，将柱放于离心管，以10 000 r/min离 心30 s。离心后滤液存留于离心管内，从离心管中取75 pL 样液分别加入75 gL正离子内标或75 gL负离子内标，涡旋 振荡20 s,上机进样叫

　　

　　1.2.3色谱条件

　　

　　色谱柱 ACQUITY UPLC BEH C18, 1.7 um, 2.1 mmx 100 mm；柱温：40 °C；流速：0.3 mL/min；进样量： 5hL；流动相A为乙腊溶液，B为0.1%甲酸水(ESI+) /0.01% 氨水溶液(ESI-),梯度洗脱条件如表3所示。

　　

　　1.2.4质谱条件

　　

　　电喷雾离子源(Electrospray ionization, ESI):正离子、 负离子分别扫描；离子源温度：正离子模式600 °C,负离 子模式520 °C；气帘气：20 psi；碰撞气：中等；电喷雾电 压：正离子模式：5 500 V,负离子模式：4 500 V； Gasl： 55 psi, Gas2： 50 psi；其他质谱条件参见表4。

　　

　　2结果与分析

　　

　　2.1前处理方法的选择

　　

　　本研究釆用MycoSpin ™ 400多功能净化柱，进一步优 化提取时间和提取溶剂等条件。釆用MycoSpin ™ 400净化 柱能满足对所有真菌毒素回收率均能达到70%〜130%。

　　

　　2.2流动相的选择

　　

　　运用相同的洗脱程序，选择3种不同的流动相对15种 化合物进行分析。结果显示流动相A设置：乙睛；流动相 B设置：0.1%甲酸水(ESI+) /0.01%氨水溶液(ESI-) , 15 种真菌毒素均有较好的响应。

　　

　　2.3质谱条件的优化

　　

　　本试验釆用对于极性特征化合物具有良好电离作用的 ESI电离源，将各真菌毒素的高浓度标准溶液釆用单标进样, 根据已确定的色谱条件，通过比较确定各真菌毒素的离子化 模式。在选定的离子化模式基础上，不断调节毛细管电压、 锥孔电压、源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔气 流量等质谱参数来进一步提高各母离子的信号水平[4]»在确 定各化合物母离子后，通过扫描方式获得2个以上的子离子, 在丰度由大到小且避免产生相互干扰的原则下，每种真菌毒 素化合物最终确定了 2个监测离子对。通过15种真菌毒素 的多反应监测(Multitude Reaction Mode, MRM)色谱图，质 谱条件可以保证质谱峰的良好峰型和丰度。

　　

　　2.4方法学考察

　　

　　2.4.1线性关系、检出限以及定量限

　　

　　配制标准溶液，将15种真菌毒素混标和正负离子内标 混合，绘制标准曲线，结果见表5。由表5可知，15种真菌 毒素在各自的线性范围内均可得到良好的线性关系，相关系 数（产）均能达到0.995以上。真菌毒素的检出限用3倍信噪 比来确定，而定量限则用10倍信噪比来确定，其中，信噪 比为S比N的比值。

　　

　　2.4.2回收率和精密度

　　

　　选择花生、玉米、小米、慧米和花生油等不同基质的样 品，检査15种真菌毒素在低、中和高浓度下的回收率。结 果见表6。在低、中和高水平下，这15种真菌毒素的平均 回收率为68.87%〜109.24%,精密度在1.97%〜12.88%。 2.5食品检测中的应用

　　

　　通过文献搜索和过去3年来自国家市场监督管理总局公示 的不合格样品信息，选定生产日期为2019—2020年，标识生 产者地址为广西、上海、浙江、江苏、辽宁和四川等地的150 批次食品样品，地区类型包括城市、农村地区、风景名胜旅游 区和校园周边。釆样环节包括常规釆样、农产品釆样和网络釆 样。抽样地点包括农贸市场、杂货店、超级市场和网络购物。 样品种厢花生、球、慧米、小米、花生油、大豆油、甜面 酱、番茄酱、芝麻酱、酱油。釆用建立的UPLC-MS/MS的方 法对150份上述类别中的10种食品进行检测，结果见表7。

　　

　　由表7可知，花生油中黄曲霉毒素B］阳性检出率最高， 高达32.00%,慧米的玉米赤霉烯酮阳性检出率较高，高达 31.81%,而玉米的玉米赤霉烯酮阳性率也达到15.00%,这 可能是由于镰刀菌属的菌株易在惹米和玉米作物中生长繁 殖，且常存在多种毒素同时并存的情况，比如部分花生样品 中同时含有黄曲霉毒素B］和伏马毒素B］,部分花生油同时 检出黄曲霉毒素B］和黄曲霉毒素B2.

　　

　　3结语

　　

　　本研究基于MycoSpin ™ 400前处理技术以及同位素内标稀 释技术，结合超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了一种粮 油食品中15种真菌毒素的检测 g 1次预处理以及1次进样 即可同时检测食物中多种真菌毒素。同时，运用定性以及定量 离子进行蛔 捷、颇、低赫、高性能、高标准、

　　

　　环保、灵敏度高、结果准确可靠，可同时检测痕量不同的真菌 毒素和代谢产物，适用于食品中多种真菌毒素的同时检测。

　　

　　参考文献

　　

　　[1]王瑞国，苏晓鸥，程芳芳，等.液相色谱-串联质谱法测 定饲料原料中26种霉菌毒素[J],分析化学2015,43(2):264270.

　　

　　[2]马帅，王蒙，韩平，等,QuEChERS-超高效液相色谱- 串联质谱法在食品真菌毒素检测中应用的研究进展[J].食品安 全质量检测学报,2016,7(8):3020-3024.

　　

　　[3]张大伟，高和杨，周旌，等.超高效液相色谱-串联质 谱法同时检测饲料原料、饲料成品中18种真菌毒素含量[J]. 食品安全质量检测学报,2018,9(22):5867-5876.

　　

　　[4]刘家阳，张月辉，贾宏新.凝胶渗透色谱净化-超高效 液相色谱-串联质谱法同时检测玉米粉中10种真菌毒素[J]. 中国食品卫生杂志＞2016,28(6):763-768.