□  陈磊 马鞍山市市场监管综合行政执法支队
摘　要：本文旨在建立高效液相色谱法同时测定绿豆糕中的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸，样品经正己烷去除油脂、硫酸锌-氢氧化钠去除蛋白质，然后采用色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇和0.02mol/L乙酸铵（pH值8.0）溶液为流动相,按照5∶95的比例进行等度洗脱，DAD检测波长为230nm，以保留时间和待测物的紫外吸收光谱进行定性分析、外标法进行定量分析。结果显示，5种食品添加剂的线性范围为0.5~100mg/L（r2＞0.999），检出限为0.12~0.64mg/kg，平均回收率为94.0%~99.9%，相对标准偏差为0.72%~1.31%。由此可见，该方法可实现对绿豆糕中5种常见食品添加剂的同时检测，具有高效、准确、灵敏的特点。
关键词：高效液相色谱  食品添加剂  绿豆糕
随着人们生活水平的不断提升，对于食品安全的要求也随之增高。绿豆糕是百姓家中常备的糕点之一，参照《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）[1]，糕点中可添加的食品添加剂种类繁多，但市面上销售的绿豆糕配料表中常见的添加剂种类为防腐剂和甜味剂。安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸是较为常见的防腐剂和甜味剂种类，由于它们都是人工合成的化学物质，故具有一定的毒性[2-4]。因此，《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）[1]中规定了它们的最大使用量。为了避免企业过量使用食品添加剂，故需要通过简单、快捷的检测手段对市场上流通的产品进行监管。
当前，对安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸的检测多采用高效液相色谱法，且会在样品前处理中使用亚铁氰化钾和乙酸锌作为沉淀剂[5-8]。通过日常的检验过程发现，亚铁氰化钾和乙酸锌作为沉淀剂会造成样品中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸这5种食品添加剂在色谱条件下的出峰时间发生改变而造成结果的误判。因此，本文在测定时选择更为合适的沉淀剂并对流动相的条件加以优化来消除脱氢乙酸的拖尾现象，从而高效、准确地测定绿豆糕中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸的含量。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
U3000型高效液相色谱仪，赛默飞（美国），配DAD检测器；ME204/02型万分之一天平，梅特勒-托利多（瑞士）；Arium-Pro型纯水系统，赛多利斯（德国）；S-700B型多参数测试仪，梅特勒-托利多（瑞士）；T18型分散机，IKA（德国）；0.22μm水相微孔滤膜，CNW（德国），HC-3018型离心机，中科中佳（中国）。
1.1.2 试剂
安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠，均由德国Dr.Ehrenstorfer公司提供，于20±4℃下保存；脱氢乙酸由美国Chem Service公司提供，于4℃下保存。
甲醇、乙酸、正己烷，均为色谱纯，由TEDIA提供；乙酸铵为色谱纯，阿拉丁；氨水、硫酸锌、亚铁氰化钾、乙酸锌、硫酸铜、氢氧化钠，均为分析纯，由国药提供；实验室用水均为超纯水。
乙酸铵溶液（0.02mol/L，pH值8.0）：称取乙酸铵1.54g，加水溶解并稀释至1000mL，用氨水调节pH值至8.0。
硫酸锌溶液（120g/L）：称取120g硫酸锌，加水溶解并稀释至1000mL。
亚铁氰化钾溶液（106g/L）：称取106g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至1000mL。
乙酸锌溶液（220g/L）：称取220g乙酸锌，加入30mL乙酸，加水溶解并稀释至1000mL。
硫酸铜溶液（100g/L）：称取100g硫酸铜，加水溶解并稀释至1000mL。
氢氧化钠溶液（20g/L）：称取20g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000mL。
氢氧化钠溶液（40g/L）：称取40g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000mL。
安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸标准混合储备液（1mg/mL）：分别称取适量的5种食品添加剂置于烧杯中，加入10mL氢氧化钠溶液（20g/L）和适量的水溶解，转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。
安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸标准工作液：分别移取适量的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸标准混合储备液至10mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。

1.2 色谱条件
月旭Ultimate C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱温：35℃；流量：1.0mL/min；进样量：10μL；检测波长：230nm；流动相：0.02mol/L乙酸铵溶液（pH值8.0）∶甲醇=95∶5（V∶V）。

1.3 实验方法
称取2.0g（精确至0.1mg）样品置于50mL离心管中，加入20mL纯水、2mL硫酸锌（120g/L）、1.5mL氢氧化钠（40g/L），匀浆，10000r/min离心5min，取上清液于250mL分液漏斗中。然后，在残渣中加入20mL纯水，匀浆，10000r/min离心5min，合并上清液于250mL分液漏斗中。之后，在分液漏斗中加入15mL正己烷，振荡5min，静置分层，取下层溶液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，过0.22μm水相微孔滤膜，待测。

2 结果与讨论
2.1 沉淀剂的选择
目前，在检测安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸时大多选择亚铁氰化钾-乙酸锌[9-10]体系作为沉淀剂，其虽然对于蛋白质的沉淀效果明显，但按照色谱条件进行测试时发现存在使样品中的5种目标物质出峰时间与标准物质出峰时间不一致的现象。由此推测，可能是亚铁氰化钾的配位作用造成5种目标物质的性质发生变化。
本文同时试验硫酸锌-氢氧化钠[11]和硫酸铜-氢氧化钠[12]两种体系的沉淀剂，二者对于蛋白质的沉淀均有显著效果，但由于硫酸铜属于有毒物质，不利于环保和实验室安全，故本文最终选择硫酸锌-氢氧化钠体系作为沉淀剂。

2.2 流动相的改进
测定安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸时通常使用0.02moL/L乙酸铵和甲醇为流动相[3-10]，以体积比95∶5进行等度洗脱，以此分离以上5种食品添加剂。在此流动相下分析以上5种食品添加剂不仅耗费时间长，且脱氢乙酸的峰型存在拖尾现象。调节流动相的pH值可以抑制脱氢乙酸水解而造成峰型拖尾的现象，故本文通过氨水调节0.02moL/L乙酸铵的pH值，并比对pH值为5.0、6.0、7.0、8.0时的色谱图。最后发现，当乙酸铵的pH值为8.0时，5种食品添加剂的分离效果较好，且脱氢乙酸无拖尾现象（如图1）。

2.3 检测波长的选择
利用DAD检测器分别对安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸进行波长扫描，各组分的最大吸收波长分别为安赛蜜（226nm）、苯甲酸（223nm）、山梨酸（254nm）、糖精钠（207nm）、脱氢乙酸（230nm）。最终，综合考虑各组分的响应值，选择230nm作为最终的检测波长。

2.4 工作曲线和检出限
按照实验方法，对浓度分别为0.5、1、5、10、50、100mg/L的标准系列溶液进行测定，以5种食品添加剂的质量浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线。结果表明，5种食品添加剂的质量浓度与其对应的峰面积之间呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表1。

将混标添加在空白基质样品中，在相同条件下进行6次平行试验，按照3倍信噪比考察5种食品添加剂的检出限，具体结果见表1。

2.5 回收试验
分别称取绿豆糕阴性样品2.0g（精确至0.1mg），按照实验方法对其进行不同浓度水平的加标回收试验，每一个浓度平行进行6次实验，计算回收率，结果见表2。

3 结果与讨论
本文建立了氢氧化钠-硫酸锌体系作为沉淀剂的液-液萃取方法对绿豆糕进行前处理，使用高效液相色谱-DAD检测器于230nm波长下同时测定安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸这5种食品添加剂。该方法操作简便、准确度高，优化后的色谱条件出峰快、峰形好，分离度符合要求，适用于绿豆糕中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸这5种食品添加剂的定性和定量分析。

参考文献：
[1] 《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）[S].
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[12] 杨海昕，曹云，肖君.高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸前处理方法探讨.江苏预防医学[J]，2015(26):100-102.