□ 上海博尔卡国际贸易有限公司 供稿

生乳(原料乳)是乳制品的基础原料，一般情况下，生乳中的微生物主要是一些无害的细菌，但在后续的成品生产过程仍需经杀菌处理。因此，《食品安全国家标准 生乳》(GB 19301-2010)中并没有规定生乳的致病菌检测标准，仅要求菌落总数限量≤2×106cfu/mL(g)。

实际上，监控食品中微生物的种类有利于寻找污染源头，把控产品质量。在常见的微生物种类中，芽孢杆菌属广泛存在于牧场环境和动物饲料中，故在生乳中的检出频率较高。其中，部分致病菌会产生非常耐热的毒素。以蜡样芽孢杆菌为例，其芽孢需在100℃的高温下持续20min以上才能被杀死。同时，蜡样芽孢杆菌是条件致病菌，且产生肠毒素的条件较为苛刻，大多数情况下菌量保持在较高水平，即≥105CFU/mL(g)【《蜡样芽胞杆菌食物中毒诊断标准及处理原则》(WS/T82-1996)】，少数情况下较低菌量也会引起食物中毒。由于生乳营养丰富，且在适宜温度(28~35℃)下极易使蜡样芽孢杆菌大量生长繁殖，因此，将该菌的检测纳入风险监控对保证乳品安全具有重要意义。

图1 MYP 培养基上呈微粉红色的典型菌落

目前，生乳中蜡样芽孢杆菌的检测主要有如下两项难点。

1 MYP平板中的菌落容易蔓延

《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》(GB 4789.14-2014)选用甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)培养基，其中的典型菌落为微粉红色(表示不发酵甘露醇)，周围有白色至淡粉红色沉淀环(表示产卵磷脂酶)，经过纯化培养后再进行镜检和生化鉴定。

然而，由于MYP特异性较低，且在检测诸如生乳这种微生物种类及含量均较多的样品时，卵磷脂酶分解培养基中的卵黄会产生沉淀带，容易使菌落之间漫延连接，导致部分非目标种类菌发酵甘露醇将整个平板“染成”黄色，进而难以鉴定和计数，致使不能准确出具检测报告。

图2 菌落漫延连接且部分种类非目标菌发酵甘露醇将整个平板“染成”黄色

2 蜡样芽孢杆菌组(B.cereus group)中其它菌种的干扰

蜡样芽孢杆菌的生化特征与其同组(蜡样芽孢杆菌组B.cereus group)的苏云金杆菌非常相似，参照GB 4789.14-2014中的生化鉴定要求，二者的区别仅仅是后者在芽孢形成时能产伴胞晶体，且该伴胞晶体大部分存在于细胞内，极少数部分游离。因此，需要延长菌落在纯化平板上的培养时间(3天以上)，并通过电子显微镜观察有无伴胞晶体来区分二者;或将待测菌落细胞壁打破，在大量增加游离的伴孢晶体数量的情况下使用相对应的特异性抗体类产品进行检测。

图3 蜡样芽孢杆菌标准菌株加入生乳后在显色平板上的生长情况

因为单个典型菌落难以分离，所以容易导致后续鉴定更加困难。博尔卡(Biokar)的COMPASS® BACILLUS CEREUS显色培养基可以有效解决上述问题——其特殊的选择性成分可以避免绝大多数污染菌群的干扰，显色底物与COMPASS® BACILLUS CERE US琼脂配方中选择剂之间的相关性允许仅在孵育24小时后直接计数特征性菌落，且无需确认。目前，该方法已经获得AFRNOR认证。图3为蜡样芽孢杆菌标准菌株(CMCC(B)63303)加入生乳后在显色平板上的生长情况(与图2为同一样品)，蜡样芽孢杆菌呈现典型的蓝绿色，白色菌落为非蜡样芽孢杆菌。此外，镜检时如观察不到芽孢结构，继续培养1~2天即可，如图4。

图4 镜检时的菌落

为确保COMPASS® BACILLUS CEREUS显色培养基快速检测方法的准确性，博尔卡使用41株不同的干扰菌株及41株蜡样芽孢杆菌组内菌株(不同种类或分型)进行了验证，并取得了令人满意的结果——在克服传统方法部分劣势的同时缩短了检测时间，证明该方法对实验室检测工作效率的提升具有十分重要的意义。