□ 贾南南 李建平 范美霞 菏泽市食品药品检验检测研究院

摘　要：本文旨在建立实时荧光PCR检测熟牛肉中牛、猪、马等动物源性成分的方法。通过对菏泽市市售熟牛肉进行采样检测，提取熟牛肉中总DNA后进行实时荧光PCR检测，确定Ct值，分析样品熟牛肉中牛、猪、马源性成分。通过检测DNA提取液(纯度1.6~1.7)，便能满足实时荧光PCR的检测要求。本次采样检测的12批样品中，2批既检出牛源性成分又检出马源性成分，说明样本可能存在马肉掺假为牛肉的问题。

1 引言

随着社会的发展，人们的生活水平不断提高，对肉制品的要求也越来越高。但是，肉制品市场存在肉类掺假、以次充好等欺骗消费者的行为，不法商贩为了追求自身利益以“挂羊头卖狗肉”的方式用劣质肉冒充高质量的肉制品。利用常规的检测方法只能从感官及形态上鉴别肉类，无法从溯源层面解决肉类掺假的问题，例如对于腌制加工的熟牛肉，消费者就很难通过肉眼辨别其是否为牛肉。

随着分子生物学的发展，以DNA为基础的PCR技术被广泛应用于动物源性成分的检测[1-4]，即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)溯源是以DNA遗传物质为基础鉴别肉及肉制品。聚合酶链式反应是一种在体外特异性扩增DNA序列的技术，其基本过程为3个阶段的多次循环——模板双链DNA的变性、引物与模板DNA的退火、在DNA聚合酶引导下的链延伸反应，且每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板。就理论而言，扩增产物量呈指数形式上升，即经过n个循环后，产物量增加到2n倍。此方法在动物源性成分检测、肉类掺假鉴别等应用上已有多个报道[7，8]。本研究针对菏泽市市场上销售的肉及肉制品进行抽样检测，利用实时荧光PCR方法鉴别牛、猪、马源性成分，以期发现是否存在掺假的情况，旨在为肉制品掺假检测提供一定的参考依据。

2 材料和方法

2.1 材料

12份市售熟牛肉。

2.2 仪器

绞肉机，小熊电器股份有限公司;金属浴，杭州奥盛仪器有限公司;Rotor Gene Q 荧光定量PCR仪，德国凯杰。

2.3 试剂

无水乙醇，天津市富宇精细化工有限公司;DNA提取试剂盒，天根生物公司;猪源性检测试剂盒、牛源性检测试剂盒，Takara公司;马引物及探针(SN/T3730.5-2013)、PCR体系预混液2xTaqMan Fast qPCR Master Mix(Probe qPCR)，上海生工合成。

2.4 样品处理

取适量样品放入烧杯中，用温水冲洗并挤干水分，往复数次，用干净的绞肉机粉碎，备用。

2.5 样品总DNA提取

按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。

2.6 DNA纯度与浓度

打开核酸蛋白检测仪，吸取 DNA溶解液2μL加入加样口，分别测定260nm与280nm吸光度，测定DNA提取液的浓度和纯度。

2.7 聚合酶链式反应(PCR)

2.7.1牛源性实时荧光PCR反应

以提取的各个DNA样品为模板，按牛源性检测试剂盒说明书操作。

图 1 牛源性成分检测

2.7.2 猪源性实时荧光PCR反应

以提取的各个DNA样品为模板，按猪源性检测试剂盒说明书操作。

图 3 猪源性成分检测

2.7.3 马成分检测

以提取的各个DNA样品为模板，作阳性对照、阴性对照、空白对照。

反应体系：2xTaqMan Fast qPCR Master Mix 10μL、10μM Forward Prime 0.4μL、10μM Reverse Primer 0.4μL、10μM probe 0.4μL、DNF Buffer 2μL、模板DNA 1μL、dH2O 5.8μL。

反应条件：预变性94℃3min，变性94℃5s，退火延伸60℃30s(收集荧光信号)，40个循环。

图 2 马成分检测

3 结果与分析

3.1 DNA模板质量

所有样品DNA提取液OD260/OD280值为1.6~1.7，浓度为50~100ng/μL，模板DNA在纯度及浓度上都能够满足进行PCR检测的要求。

3.2 实时荧光PCR 检测结果

分别配制牛、猪源性荧光PCR反应体系和马成分荧光PCR反应体系，Ct值如表1所示。当样品的Ct值不为0且小于35，并有典型的扩增曲线时，则判定样品检出该动物源性成分;反之则为未检出该动物源性成分。

4 讨论

动物源性食品大多为动物组织，其结构紧密，富含蛋白质、脂肪等大分子物质，而熟肉制品在制作过程添加了入味调料等，这些物质会在DNA提取过程中产生共沉淀，倘若提取不当将会影响后续PCR检测。因此，在提取DNA的过程中，去除杂质，得到高DNA纯度尤为重要。本方法在前处理时用温水多次洗涤，去除入味的香料和盐等成分，DNA提取采用试剂盒介质吸附法(硅基质)，DNA纯度高，杂质等抑制物少，是PCR成功的保证。检测结果显示，所抽取的市售12批样本中均检出牛源性成分，2批既检出牛源性成分又检出马成分，说明样本可能存在马肉掺假为牛肉的问题。

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