MALDI Biotyper®提高了中国工业微生物菌种保藏中心微生物鉴定的准确性和速度

□ 姚粟 翟磊 中国工业微生物菌种保藏中心

对食品、制药、化妆品、饲料和环境行业的工业微生物样品进行专家测试和分析，对于保证合规性、了解制造业所用物质的组成及其完整性至关重要。现如今，由于各实验室面临的压力越来越大——必须在严格的期限内完成任务并达到关键绩效指标(KPI)，因此兼具高精度与快速获得鉴定结果能力的分析方法愈发成为优选解决方案。经研究，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)结合Bruker MALDI Biotyper®(MBT)技术可在众多工业部门实现样品鉴定结果的快速获取，并能够帮助实验室完成既定目标。

图1 CICC使用MALDI Biotyper®进行微生物鉴定

MALDI-TOF MS在行动

中国工业微生物菌种保藏中心(以下简称“CICC”)是一家业务繁忙的国家级微生物鉴定与菌株保存中心，为提高用户响应速度，该中心选择与Bruker(布鲁克)开展合作以获得支持。

CICC之所以选择MBT进行快速鉴定，是因为它可以通过扩展本地数据库来鉴定先前未能明确鉴定的微生物。当前，CICC的菌种库收集了超过12000个工业微生物菌株及300000个微生物副本，故选择MBT有助于菌株的快速鉴定。相信未来随着新菌株鉴定技术的发展，CICC菌种库的收集数量也将不断增加。此外，采用MBT能够显著提升CICC的工作效率——以往鉴定一个菌株需要24小时甚至更长的时间，而该方法在几分钟内即可完成鉴定。MBT的另一项关键优势在于其简单的工作流程，如图2。由于MBT对细菌和真菌的分析流程相同，因此无需事先区分细菌和真菌，所有未知样本放在一起分析即可。

图2 利用MALDI Biotyper®鉴定未知样本的工作流程

通常情况下，分析所用的样本是在选择性或非选择性培养基上挑取分离出单菌落的一部分，然后将分离物转移到一个MALDI靶上，并由基质覆盖。CICC利用MALDI-TOF质谱原理，结合MBT Compass软件和参考数据库，能够获得供MBT分析的质谱。该方法通过将生成的质谱与参考数据库进行比较来鉴定分离物，并可根据显示匹配提示，在难以区分高度相关物种或仅在属级进行鉴定的情况下给出明确的结果。同时，CICC还可以此创建自己的参考谱图来开发自定义数据库。

在难以对某个菌株进行可靠鉴定时，特别是在菌株来源差异较大的情况下，如来自食品、化妆品或水中的菌株，则可采用结合各种技术和原理的多相方法。当缺少相应的参考谱图时，某些菌株可能无法通过MBT进行鉴定，因此CICC等实验室可以依据多相方法来补充或扩展数据库以提高鉴定结果的准确性。

进一步扩充CICC数据库

目前，CICC已采用MBT分析了数以百计的菌株，其中，大多数菌株准确鉴定到种水平，评分值高于或等于2.0。但是，当无法通过MBT进行菌株鉴定时，可以选择生化试验和16S rRNA基因测序作为菌株鉴定的替代方法。利用该技术，CICC能够对来自包装食品、饮料、化妆品及其它消费品等行业的各种菌株进行鉴定。

图3 用于创建CICC内部数据库的代表性菌株的质谱图

一旦通过多相方法进行鉴定，菌株就会被添加到CICC数据库中以提高未来MBT的鉴定准确率。菌株经TSA平板培养，并根据Bruker样品制备程序挑选单个菌落制备样品以创建参考质谱(MSP)并扩充数据库。表1列举了经多相方法鉴定并用来扩充CICC数据库的菌株，相关菌株的质谱图如图3所示。

发现新的分离物

当前，MBT已经实现了为CICC提供快速、高准确度鉴定结果的目标。此外，如果数据库未能包括足够的生物多样性以确保鉴定结果的可靠，那么结合MBT技术与CICC开发的多相方法能通过创建新的MSP并将其添加到数据库中，从而准确鉴定更多的分离物。同时，扩展后的数据库可确保以前显示无可靠鉴定结果的分离物得到可靠的鉴定结果。

2019年4月，最新版本的MBT Compass参考数据库发布，包含了2969个物种和8468个MPS。其中，增加了一些工业微生物的常见菌种，包括在CICC研究中鉴定出的耐热细菌(如萎缩芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或腐殖类芽孢杆菌)，以及环境微生物(如海生库克菌和栖稻假单胞菌等)。接下来，CICC将会继续与布鲁克合作扩充数据库，并为广大用户提供更加快速、准确和可靠的鉴定结果。