□ 王培 山东省粮油检测中心

□ 王春霞 山东中储粮粮油质监中心有限公司

□ 巩性涛 山东省粮油检测中心

□ 贺丽丽 拜发分析系统销售(北京)有限公司

图1 黄曲霉毒素B1的化学结构式

黄曲霉毒素(AFT)是主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)、红绶曲霉(Aspergillus nomius)和寄生霉菌(Aspergillus parasiticus)所产生的次生代谢产物，包括AFTG2、AFTG1、AFTB2和AFTB1。其中，AFTB1的毒性最大。早在2002年AFTB1就被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer)归类为I类致癌物，其致癌性和致突变毒性对人类健康构成了重大威胁。我国《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2011)中对食品中AFTB1的最低限量规定为0.5μg/kg，以控制人体对AFTB1的摄入量，从而使其对人体的危害降到最低。

为了满足现行国家标准对AFTB1限量的规定，以及对AFTB1的毒理学进行风险评估，需要建立一种可靠且准确的检测方法。其中，仪器分析方法被认为是相对准确的方法，适用于较为复杂的基质分析。由于各种天然基质和加工食品基质的复杂性，以及极低限量的要求，因此需要在仪器分析之前对样品进行合适的提取、富集与净化。《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》(GB 5009.22-2016)要求，AFTB1主要通过水和有机试剂(甲醇或者乙腈)的混合液来提取。目前，固相萃取(solid phase extraction，SPE)或免疫亲和柱萃取(Immunoaffinity Column，IAC)的方法能够简化前处理步骤，提高对AFTB1的选择性。与传统的SPE法相比，IAC法能够获得更好的回收率及净化效果。然而，传统的离线IAC法同样存在着一些弊端，如耗时长、有机试剂的使用量大、免疫亲和柱只能单次使用、价格成本以及劳动成本较高、不具备可溯源性等。

图2 RIDA®CREST

本文根据GB 5009.22-2016建立了一种在线免疫亲和柱结合RIDA® CREST在线固相萃取的装置，配合液相色谱荧光检测器能够实现对植物油中AFTB1的快速定量方法。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

高效液相色谱仪和RIDA® CREST在线固相萃取装置，德国R-Biopharm公司;RF-20A荧光检测器，日本Shimadzu公司;KOBRA®CELL柱后衍生池，德国R-Biopharm公司。

植物油样品，山东省粮油检测中心;AFTB1标准品(25μg/mL)，美国Trilogy公司;黄曲霉总量标准品(5μg/mL)，美国Trilogy公司;SUPELCOSILTM LC-18(150×4.6mm,5μm)，美国Sigma公司;在线AFT免疫亲和柱(1×10mm，RBRP900)、离线免疫亲和柱(RBRP70N)，德国R-Biopharm公司;甲醇、甲酸和乙腈均为色谱纯，购自德国Merck公司;超纯水使用美国Millipore公司的Milli-Q水纯化系统制备;其它化学试剂均为分析纯。

1.2 液相条件

1.2.1在线固相萃取-高效液相色谱法测定条件

色谱条件：色谱柱为SUPELCOSILTM LC-18(150×4.6mm，5μm);流动相A为含120mg/L溴化钾和350μL 4M硝酸的水/甲醇/乙腈(62/26/12，V/V/V)溶液，B为甲醇/水溶液(90/10，V/V);流速为1.8mL/min;柱温：27℃;进样体积：1000μL;荧光检测器激发波长：360nm，发射波长：430nm。

在线固相萃取条件：

①在线固相萃取柱：IMMUNOPREP® ONLINE AFLATOXIN(Art.No.:RBRPP900);

②活化液：20mM乙酸铵，调节pH至6.80~7.00;

③淋洗液：含20mM乙酸铵和1%Triton X-100(W/V)的水/甲醇/乙腈溶液(90/6/4，V/V/V)，调节pH至8.30~8.50;

④洗脱液：含50mM乙酸铵的水/甲醇/乙腈(62/26/12，V/V/V)，调节pH至1.95~2.05。

1.2.2离线液相条件

色谱条件：

①色谱柱为SUPELCOSILTM LC-18(150×4.6mm，5μm);

②流动相A为含120mg/L溴化钾和350μL 4M硝酸的水溶液，B为甲醇，等梯度洗脱条件A︰B=60︰40(V/V);

③流速为1.0mL/min;

④柱温：40℃;

⑤进样体积：50μL。

图3 IMMUNOPREP®ONLINE

1.3 植物油样品预处理

1.3.1在线系统样品预处理

准确称取5g样品至50mL离心管中，加入70%的甲醇水溶液20mL，静置10min，涡旋5min，6000r/min下离心10min;取上清液用3% Tritox X-100水(W/V)溶液稀释10倍，取2.0mL以备进样。

1.3.2 离线免疫亲和柱样品提取及净化步骤

准确称取5g样品至50mL离心管中，加入70%的甲醇水溶液20mL，静置10min，涡旋5min，6000r/min下离心10min;取上清液4mL，用23mL含有1% Tween-20的PBST进行稀释，稀释液全部通过免疫亲和柱，自然重力速度滴下。取10mL PBS淋洗免疫亲和柱。吹干免疫亲和柱中残留的液体，用2mL甲醇洗脱，50℃下N2吹至近干，用流动相复溶，过0.22µm小滤头，作为样品备用。

2 结果与讨论

2.1 在线固相萃取原理

图4 在线固相萃取装置流程图

在线固相装置主要包含两个元件，即自动柱交换装置(Automated Cartridge Extraction，ACE)和高压分配器装置(High Pressure Dipenser，HPD)，具体见图4。HPD将自动进样器装置和ACE装置连接在一起，能够对固相萃取所需溶剂的流速和体积进行准确地分配。HPD的主要功能是吸取活化液、淋洗液和洗脱液等。ACE则拥有两个密接夹，左密接夹可以实现固相萃取中小柱的活化、平衡、上样和淋洗步骤;待小柱淋洗好之后，小柱被机械臂自动地转移至右密接夹上，并与液相分析柱联通;在线免疫亲和柱上被捕获的黄曲霉毒素被洗脱下来，流过液相分析柱，并自动进行数据采集洗脱完毕，使用活化液冲洗小柱以实现其再生。同时，HPD可以对多种溶剂或混合的溶剂进行分配，因此更加有助于对自动化固相萃取方法的开发。整套装置通过操作软件Clarity v6.1(DataApex，Czech)进行控制。

2.2 在线固相萃取-高效液相色谱法的线性范围、检出限及定量限

取AFTB1原液，用甲醇配置成1ng/mL的标准溶液。适量吸取上述标准溶液，用3% Tritox-100水溶液配制成质量浓度分别为5、10、25、50、100ng/L的系列标准溶液，在“1.2”的条件下，依次进样1000μL，经两根在线AFT可重复利用小柱依次固相萃取后进入色谱柱进行分析，以峰面积为y轴，AFTB1的浓度为x轴，通过Clarity v6.1绘制标准曲线，y=21879.40192x-43.82728，R2=0.9999)，采用外标法定量，标准曲线见图5。

通过对空白植物油添加低浓度的AFTB1标准溶液，按照在线固相萃取-高效液相色谱法进行预处理，在“1.2”的条件下进样1000μL进行分析，以性噪比(S/N)为3作为样品的检出限(LOD)，以性噪比(S/N)为10作为方法的定量限(LOQ)。最终得出，该方法的LOD和LOQ分别为0.03μg/kg和0.09μg/kg。

图5 AFTB1标准曲线液相色谱图

2.3 在线固相萃取-高效液相色谱法的加标回收实验及精密度

向植物油中添加低、中、高3个水平的AFTB1标准品，每个添加水平平行3次，考察在线固相萃取-高效液相色谱法的回收率及精密度，结果见表3。该结果表明，3个水平的加标回收率在95.13%~101.87%，精密度为1.36%~3.17%。取阳性植物油考核样进行检测，结果表示，其平均回收率为98.97%，作日内精密度(n=6),结果显示日内精密度为1.75%。因此，建立的在线固相萃取-高效液相色谱法具有良好的重现性和稳定性。

2.4 在线免疫亲和-液相色谱法和离线免疫亲和-液相色谱法检测植物油中黄曲霉毒素总量的比较

用“1.3.2”与“1.2.2”的离线样品净化方法及液相方法对24个植物油样品中的黄曲霉总量进行检测，这些样品同时被在线系统同步检测，其检测结果见表5。

如表5所示，上述两种方法对25个天然样品的检测结果基本相符。但也能明显看出，在线系统整体的检测值略高于离线方法，其主要有两大原因：其一是离线人工操作的步骤太多，容易引起误差;其二是氮吹会引起所提取样品中黄曲霉毒素的损失，这也说明在线系统的标准化机械化操作不需要氮吹的步骤确实能提高检测灵敏度。

本实验一共有25个样品，从称样开始到样品处理结束后准确上液相进行检测，离线免疫亲和柱需要一位实验人员不间断工作10个小时左右。反观在线检测，约3个小时就可以得到上机的样品。得到整个分析结果，离线大约需要20个小时，而在线大约需要12个小时。从实际样品的检测效率来看，在线系统大大节省了劳动力，提高了工作效率。

3 结论

本文采用在线AFT免疫亲和柱对植物油中的AFTB1进行富集与净化，结合RIDA® CREST实现固相萃取的全自动化，建立的在线固相萃取-高效液相色谱法只需进行提取和离心的预处理步骤就可以实现样品处理。此外，预处理后，一个样品从上柱到得到分析结果的平均时间大约为15分钟，平均每天可以处理80个样品。由此看来，本方法不仅大大缩短了样品预处理的时间，减少了有毒有机试剂的使用，提升了工作效率，而且在线免疫亲和柱可以在线重复多次使用，节约了分析成本，提高了检测结果的准确性，并具有可溯源性，能够提高政府检测单位或第三方检测机构的公信力。同时，本方法的定量限为0.09μg/kg，满足食品安全国家标准《食品中真菌毒素限量》(GB 5009.22-2016)对AFTB1检测方法的检测限要求，且与现行国标法中的离线免疫亲和柱净化样品的方法相比较，操作更为简便，可快速定量检测植物油中的AFTB1。