浅谈食品微生物检验中菌落总数和大肠菌群测定注意事项

2019-09-30 11:13:17 来源：食品安全导刊

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　　摘要：当今，食品安全问题已经成为关系广大人民群众健康利益的重大问题，我国食品安全问题形势严峻，引起了国家的高度重视，其中食品微生物污染问题历年来居于食品不合格问题的前列。本文就食品微生物学检验中常检项目菌落总数和大肠菌群测定应注意的事项进行分析与探讨，希望对同行有所借鉴。

　　关键词：食品微生物检验；菌落总数；大肠菌群；注意事项

　　随着社会的发展，人们对食物质量要求也越来越高，“吃得好”已经成为大家的普遍需求，而食品质量安全又是“吃得好”的前提。然而，食品企业在生产加工过程如果未能严格按照要求控制卫生条件，或者包装容器清洗消毒不到位，亦或储运过程不当，极易引起产品的微生物指标超标，从而使食用者健康受到危害。

　　当前，在我国食品安全监督抽检中微生物检验项目主要有菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母、致病菌4类。菌落总数反映食品被细菌污染的程度；大肠菌群反映食品是否有被粪便污染；霉菌和酵母可使食品腐败变质，并产生真菌毒素危害人体健康；致病菌可能引起食物中毒。其中，菌落总数和大肠菌群项目为科学评价食品卫生质量的重要指标，是绝大部分食品的必检项目。在2019年上半年市场监管总局公布的不合格食品中，菌落总数超标和大肠菌群超标占微生物超标总数比例分别为60.78%和11.76%[[[] 王嘉. 2019年上半年市场监管总局共公布不合格食品256批次，这七大类问题企业要关注 [N]. 中国质量报, 2019-06-28(6).]]。因此，为保障人民群众的健康安全，必须提高菌落总数和大肠菌群检测的准确性。笔者结合工作实际，就食品中菌落总数和大肠菌群测定应注意的事项进行阐述，希望对同行有所借鉴。

　　检验方法选择

　　选择正确的检验方法是检验结果准确可靠的前提。目前，食品中菌落总数测定的方法主要是GB 4789.2-2016，但是生活饮用水菌落总数测定方法却为GB/T 5750.12-2006。这两个标准最大的不同在于选用的培养基，GB 4789.2-2016 中为平板计数琼脂（PCA），而GB/T 5750.12-2006 中为营养琼脂（NA）。两者的区别在于平板计数琼脂更利于细菌的恢复和生长，同时又能防止细菌生长连成片状[2] 杨庆文, 国译丹, 周惠新, 等. 不同浓度 TTC 平板计数琼脂细菌生长试验观察[J]. 中国卫生检验杂志, 2012, 22(1): 62-63，如果采用GB 4789.2-2016测定水中菌落总数，可能导致测定结果偏高而使产品误判。

　　对于大肠菌群检测，现行的国家标准为GB 4789.3-2016，该标准包含两种方法：MPN法和平板法。MPN法是一种半定量计数方法，适用于大肠菌群含量较低的食品的检测；平板法为定量计数法，适用于大肠菌群含量较高的食品的检测。正确使用这两种方法的关键在于区分产品执行标准中限度的单位：当限度要求以“CFU/ g 或 CFU/mL”为单位时，我们应选择平板法；当以“MPN/g 或 MPN/mL”为单位的，我们应选择MPN法。然而一些特殊的产品，如酱油、醋和一些保健食品，限度要求以“MPN/100mL或MPN /100g”为单位，这时我们应选择GB/T 4789.3-2003进行检测，因为卫生部2009年第 16 号公告明确规定：现行食品标准中规定的大肠菌群指标以“MPN/100克或MPN/100毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》（GB/T4789.3-2003）进行检测。因此我们应根据样品的种类选择正确的检验方法。

　　检样处理与稀释

　　菌落总数和大肠菌群的测定均应在洁净工作区进行，所用器具均需严格灭菌。目前微生物实验室常用的灭菌方式主要为干热灭菌和湿热灭菌两类。其中干热灭菌是利用恒温干燥箱内160℃～180℃的高热，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法；湿热灭菌是利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡的一种方法。一般玻璃培养皿、刻度吸管以及金属取样工具可装入相应的不锈钢消毒桶中，然后置于热空气消毒箱160℃~180℃干热灭菌2h以提高工作效率，而含水物品如培养基、生理盐水等则需采用湿热灭菌的方法.。

　　样品取样前一定要核查样品包装的密封性和密封的完整性。检验人员要严格按照规定佩带无菌帽子、口罩、手套等，操作前用酒精棉球对手部进行消毒。取样时应注意无菌操作，一般固体样品从其不同部位称取25g置于225mL无菌生理盐水中，液体样品则吸取25mL置于225mL无菌生理盐水中。应该注意的是，国标针对不同类别食品样品前处理还有特殊的规定：如食醋和酸性饮料，由于呈酸性，需调节pH值至中性才能进行检测；调味品，如酱和酱油等，由于其本身含盐量较高，取样及稀释样品时应用无菌蒸馏水；固态、半固态乳制品取样时应将无菌生理盐水预热至45 ℃；冷冻食品取样前应在 45℃以下不超过 15 min , 或 2℃～ 5℃不超过 18 h 进行解冻。

　　菌落总数和大肠菌群检验常用的稀释液为无菌生理盐水和磷酸盐缓冲液，一般情况下两者可以通用，无任何区别。然而，对于一些酸性或碱性样品，使用磷酸盐缓冲液作为稀释液，更利于样品中微生物的存活和检出[[[] 孙慧, 李天添. 使用不同稀释液对食品中菌落总数检测结果的影响初探[J]. 酿酒, 2012, 39(1):86-88.]]。在制备10倍系列稀释样品匀液过程时，我们应根据样品受污染程度，以及产品的微生物限度选择稀释的最低倍数。比如国标对液态饮料菌落总数限度要求：n=5, c=2, m=100CFU/mL, M=10000CFU/mL，这时稀释到1：100就可以判断产品是否合格；而糕点国标菌落总数规定：n=5, c=2, m=10000 CFU/g, M=100000 CFU/g，这时就要稀释到1：1000测定才能进行判断；在盲样测定时，由于不知道样品具体菌落数，这时为保险起见应多做稀释度，一般至少稀释到10-8才能达到计数的目的。在稀释过程中，每递增稀释一次需更换一根无菌吸管或吸头，保证稀释倍数的准确性，同时应取空白稀释液做阴性对照，因为空白对照如果有细菌生长，说明培养基、稀释液、培养皿灭菌及人员操作中至少有一项未满足实验要求，检测结果无效，应逐一排查查明原因。

　　接种与培养

　　在菌落总数检验接种时，应该揭开培养皿的部分使检液从侧边进入。检液加入后，必须尽快倾注培养基混匀。倾注培养皿的培养基应保持46℃，因为温度过高培养皿中的细菌可能被烫死而影响结果的准确性，温度过低培养基将凝固。当培养皿中琼脂凝固后，将培养皿置于培养箱中36℃±1℃倒置培养48h±2h（水产品为30℃±1℃培养72h±3h），培养皿倒置培养的原因主要有3个：1.防止培养皿正置培养时水分蒸发在培养盖上形成冷凝水滴落而污染培养基；2.倒置培养后琼脂表面不会有水膜，从而促使菌落的形成；3.倒置培养后菌落生长速度适宜，形成的菌落容易计数。

　　在大肠菌群检验过程中，平板法接种注意事项和菌落总数测定相似，也包括培养基倾注的温度保持46℃，培养皿倒置培养。但是在使用MPN法测定前要注意杜氏扣管里是否有空气，以免影响后续的观察，增加工作量。在接种时应注意，当样品接种体积>1mL（一般为10mL）时应使用双料培养基，而接种量≤1mL应用单料培养基，这是因为接种体积的增大会稀释培养基使各成分浓度降低，因而使用双料培养基。

　　在大肠菌群MPN法糖发酵实验中，观察是否产气应对光倾斜观察，有时杜氏扣管中会出现比米粒还小的气泡干扰检验人员，这时可通过观察发酵液是否浑浊，继续培养是否产气来判断。对于GB/T 4789.3-2003，亦可通过观察发酵液是否变黄进行判断，以确定是否进行下一步实验。为保证实验结果准确性，应同时做阴性对照、阳性对照试验。当发现样品初发酵阳性时，必须进行证实试验，因为有许多研究表明，初发酵实验阳性的试管，证实试验结果可能为阴性。

　　在大肠菌群平板法验证试验中，可疑菌落的挑取验证往往是检验人员认为比较棘手的问题。国标规定，挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个全部挑取，这句话常常让检验人员不知如何理解。其实这里的典型菌落主要包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌，建议检验人员初次实验时取这四种细菌进行阳性对照试验，然后注意观察，并记录典型大肠菌群形态，这样就能区分出典型菌落和可疑菌落。正式试验时，挑取典型菌落和可疑菌落各10个（或全部挑取）进行验证，挑取菌落时可连同部分培养基挑出，以防漏挑。

　　计数结果

　　菌落总数和大肠菌群的计数一般按照国标规定执行即可。然而，在实际检验工作中常常会遇到菌落蔓延整个培养皿而导致无法计数的情况。笔者结合近几年的检验经验认为可以从以下几个方面解决此问题。首先，无论是菌落总数还是大肠菌群测定，都可以在凝固后的琼脂表面覆盖3~4mL相应的培养基防止菌落蔓延；其次，可以多做稀释度，在高稀释倍数计数；再次，培养过程中应每天观察，在菌落蔓延前作出记录。特殊的，对于菌落总数测定，特殊情况下，还可以尝试在平板计数琼脂里面加入TTC（氯化三苯四氮唑），TTC检测的原理是大部分细菌在代谢的过程中能产生脱氢酶，具有脱氢作用，可将无色的TTC还原，使菌落显红色，便于计数，同时抑制大片蔓延菌落的形成[4,5]。但在使用过程中应严格控制TTC的浓度，否则影响菌落计数。

　　在菌落总数和大肠菌群测定计数时，有时会遇到无法区分残渣微粒和菌落的情形。这时应仔细观察，寻找残渣与菌落的区别：一般残渣形状不规则，而菌落则相对规则；残渣颜色暗淡，而菌落则相对明亮。另外还可通过延长培养时间进行判断，因为如果为细菌，通常会继续生长。对于菌落总数测定还可以通过多接种一个平板，倾注琼脂后将其放到0℃-4℃冰箱中，待计数时作为对照；或者添加TTC使细菌染成红色进行计数。

　　此外，在菌落总数和大肠菌群计数时，还可能出现高稀释倍数培养皿细菌数与低稀释倍不成10倍关系，或高稀释倍数培养皿细菌数高于低稀释倍数，这可能是检验过程操作有误或者样品中还含有防腐剂，此时的计数结果不应作为报告结果的依据。

　　培养基的保存

　　在菌落总数和大肠菌群测定时，所用培养基是影响测定结果的一个至为关键的因素，所有培养基都应该符合GB 4789.28-2013标准要求。一些常用的培养基如平板计数琼脂、LST肉汤（月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤）、乳糖胆盐发酵管，如果一次不能完全用完，可置于4℃冰箱，一般可保存两周。平板计数琼脂可且只能融化一次使用，过多融化将影响实验结果；大肠菌群平板法中，VRBA（结晶紫中性红胆盐琼脂）应在使用前3小时内制备，以防受到污染。

　　结语：

　　食品质量安全与人们的健康生活息息相关，习近平总书记曾对食品质量安全工作作出重要指示，提出要坚持“最严谨的标准、最严格的监管、最严厉的处罚、最严肃的问责”。作为一名基层食品微生物检验人员，在食品检测技术日益发展的今天，更应该与时俱进，深刻掌握检验的相关原理以及注意要点。在菌落总数和大肠菌群时，要做到每一步骤操作精细准确，这样才能保证检验结果准确可靠，为我国食品安全监管贡献出力量。

　　参考文献

　　[1]王嘉. 2019年上半年市场监管总局共公布不合格食品256批次，这七大类问题企业要关注 [N]. 中国质量报

　　[2]杨庆文, 国译丹, 周惠新, 等. 不同浓度 TTC 平板计数琼脂细菌生长试验观察[J]. 中国卫生检验杂志

　　[3]孙慧, 李天添. 使用不同稀释液对食品中菌落总数检测结果的影响初探[J]. 酿酒

　　[4]陈晓梦. TTC检测在食品卫生微生物检验菌落总数测定中的应用分析[J]. 世界最新医学信息文摘

　　[5] 肖剑, 李慧琴, 陈楷, 等. 食品微生物能力验证样品菌落总数检验方法[J]. 食品安全质量检测学报

　　傅志丰1 周鹤2 许文蓓1

　　（1.九江市食品检验检测中心, 江西九江，332000；2.九江市食品药品检验所, 江西九江，332000）