MALDI-TOF在食品微生物中的应用：数分钟内确认和鉴定微生物

作者：Q实验室首席科学官Erin Crowley

微生物的鉴定和确认涉及许多行业，如制药、化妆品和食品。准确的微生物检测有助于制造商快速确定产品质量和安全，例如，检测可能的食品腐败生物或食源性病原菌，或监测环境病原菌或生产工程菌菌群。食品行业的监管不断收紧，不仅监管机构施加压力，消费者也在施加压力，要求对食品进行严格的检测。

一系列的微生物都可以污染食物，包括细菌、酵母菌、霉菌和寄生虫。常见的食源性致病菌包括沙门氏菌属、克罗诺杆菌属、弯曲杆菌属，以及单核细胞增生李斯特菌。如果不能尽快检测出来，它们可以通过受污染的食物引起严重的疾病爆发。通过监测大肠杆菌、李斯特菌、酵母菌和霉菌等质量指标，可对工艺卫生和食品质量进行评价。用于识别食品中的微生物的技术种类繁多，包括传统的基于培养的方法和使用聚合酶链反应(PCR)试验的分子检测，以及日益复杂的分析技术，如质谱法(MS)。由于能在属或种的水平上鉴定微生物，因此筛选得以更为深入的应用。而研究人员和测试制造商则总是在寻找更先进的方法，以便以更高的准确性和灵敏度进行更快速的测试。

质谱的发展

食品工业已经习惯于使用经AOAC或ISO 16140认可的快速检测方法。这些定性或定量方法已被食品安全管理机构接受，而且区域法规也对其应用予以认可，并鼓励将它们应用于各种各样的食品。新技术的发展，如基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱或测序技术，凭借其更快、更可靠的结果，使食品微生物检测进入21世纪。

时间往往是对食品微生物实验室最关键的因素，因此MALDI-TOF MS快速、准确地确认与鉴定微生物的能力在常规测试中具有极高价值。对比研究表明，在正确鉴定细菌和真菌方面，使用MALDI-TOF MS(100%)与使用传统鉴定板(94-97%)存在差异，MALDI-TOF MS在速度以及试剂成本方面也拥有的重大优势[1]。

Q实验室(俄亥俄州辛辛那提市)的微生物食品实验室最近采用了MALDI-TOF MS进行日常食品微生物测试以及研发(R&D)工作。微生物鉴定实验室使用标准的“工具箱”方法，其中包括标准的台式培养方法、自动生化法、镜检和16S rDNA测序。对微生物鉴定技术的内部审查，以及客户对替代方法的要求，推动了对采用MS进行鉴定工作的考虑。当时，实验室正承接专家鉴定机构外包业务，因此成立了技术进步小组(TAG)，专门负责审查当前使用和未来将要实施的技术。

食品微生物学工作被划分为两部分，即常规测试及研发(R&D)，前者由客户提交样品以确认并鉴定食品中的微生物);后者则是对客户希望推广和销售的诊断分析方法进行验证以获得认证。

MALDI-TOF MS常规测试

2017年1月，微生物食品实验室将MALDI-TOF MS添加到其用于常规微生物鉴定与研发的工具箱中。该技术可获得微生物的特征蛋白质指纹图谱，将指纹图谱与与覆盖广泛的数据库中数千个参考图谱相匹配，可以可靠鉴定特定微生物。利用现有技术可对该工具进行补充，例如，使用rDNA测序方法进行基于序列的鉴定。

这种MS技术使实验室能够提供灵活的周转时间(TAT)和成本选项，以适应客户的需求。这样就能创建出一种完全定制化的服务，例如根据需要，还有快速菌种鉴定当天出结果的选项，因而极具价值，如果采用以前的方法则无法实现。对MALDI-TOF系统结果的信心以及更高的灵敏度意味着重复测试次数更少，因此在第一次得到鉴定结果时，客户可以立即做出判定。

在发生病原菌污染的情况下，以前采用传统的生化测试方法需要3到7天。假设病原菌检测结果预判为阳性，那么确认结果所需的时间十分关键，以避免(i)延误产品召回，并导致可能的感染性微生物的爆发，或(ii)延误对病原体存在的排除，从而因保质期缩短而导致食品的浪费。食品微生物学实验室现在用MALDI-TOF MS在30分钟到2小时内完成样品分析， 可用于确认某种替代方法的疑似结果，或从平板上直接鉴定微生物。

图1：从MALDI Biotyper（MBT）获得的图谱示例（Bruker Daltonics，Bremen）。

(图注：Intensity 信号强度;Aspergillus niger 黑曲霉;Bacillus licheniformis 地衣芽孢杆菌;Listeria monocytogenes 单核细胞增生李斯特菌;Salmonella enterica ssp. 肠道沙门氏菌;Yarrowia lipolytica 解脂耶氏酵母)

验证新的分析方法

常规实验室测试样品来自食品，而研发实验室测试的“样品”则是技术本身。技术公司以及诊断合作伙伴将新的技术或分析方法带到Q实验室进行方法验证，例如，检测沙门氏菌、李斯特菌或军团菌，并要求对其工作提出建议。Q实验室与客户和方法验证组织(如美国的AOAC INTERNATIONAL)制定一种研究设计。研究应满足AOAC附录J指南要求[2]。

MicroVal和AFNOR认证是欧洲的认证机构，采用的方法是按ISO 16140标准[3，4]进行评估。“专家实验室”(在本案例中为Q实验室)，与技术提供商合作制定方法、并将其提交到认证机构以供技术审核员批准。Q实验室是北美唯一被三个主要认证机构认可的专家实验室，即AOAC、MicroVal和AFNOR认证。这使得AOAC/ISO联合验证研究的设计、以及满足所有客户需求成为可能。

协作研究

在AOAC-OMA研究或ISO 16140验证研究中，选取一个领先的内部实验室(如微生物研发实验室)进行对比协作研究，对技术的重现性进行挑战。组织实验室负责在全世界招募12到15个实验室，同意自愿对收到的盲样进行测试。所有实验室在同一天使用相同的技术对样品进行评估。分析完成后，实验室将数据提交给主导实验室进行统计分析，然后为客户生成一份完整报告，并提交给认证机构，由技术委员会进行审查并在协商一致后批准。此批准意味着该方法适用于预定目的并满足验证要求。

Q实验室对Bruker的MALDI Biotyper(MBT)进行了AOAC-OMA和ISO 16140的验证。通过结合现行指南，如AOAC附录J指南和新的ISO 16140第6部分标准[4]，创建了一个优化研究设计，以验证MBT在食品微生物分析中的应用。由于对确认与鉴定方法设计的验证尚未跟上最新的技术发展，这项研究是同类研究中的第一个。表1给出了提交AOAC-OMA和 ISO 16140批准的MBT合作研究的设计和结果汇总。

Q实验室作为两项独立研究的主导实验室，2017年12月获取了MBT的AOAC-OMA研究结果。第一种是确认与鉴定沙门氏菌、克罗诺杆菌和其它革兰氏阴性细菌(OMA#2017.09);第二种是确认与鉴定食品微生物中的单核细胞增生李斯特菌、李斯特菌属和其它革兰氏阳性细菌(OMA#2017.10)[5，6]。Q实验室也是MicroVal批准的ISO 16140专家实验室。在2018年初组织了首次研究，并获得四项证书[7]。2018年4月，在斯德哥尔摩举行的食品保护内部协会(IAFP)活动上，分别以海报和研讨会的形式，与MicroVal技术委员会成员共同发布了该结果[8，9]。

持有AOAC官方分析方法、及ISO验证/MicroVal认证级别的认证，该方法被食品药品监督管理局(FDA)接受可用于病原菌确认，并符合欧洲法规EC 2073/2005[10]。FDA和欧洲法规都要求第三方认证机构批准验证数据，并将其视为与其现有确认/鉴定方法(被视为金标准)具有同等效力的替代方法。

表1：提交AOAC-OMA和ISO 16140批准的

每项研究至少涉及来自7个实验室的14名合作者。每个合作者至少收到16个目标菌株和8个非目标菌株。

当确认率和鉴定率不同时，括号中显示的为鉴定率。

*ISO、FDA和USDA参考方法。

微生物确认与鉴定的未来

质谱法一直以来都是一种分析化学工具，最近通过了AOAC-OMA和ISO 16140认证，这证明了在微生物学家掌握下的MBT的可靠性、稳定性和重现性。将MALDI-TOF MS集成到常规测试工作流程中，可实现重大的资源整合，能取代多种传统的生化鉴定方法，并消除DNA测序中的大量步骤、工作站计量要求带来的负担。在分析前无需知道微生物的类型，因为细菌、酵母菌或霉菌都按照相同的工作流程同时进行分析。

由于对食品和环境污染物的鉴定需求不断上升，Q实验室正在扩大其通过MALDI-TOF MS和rDNA测序提供的确认与鉴定服务，并寻求增加其环境测试服务。对于一个分离的菌落，可在15分钟内获得确认/鉴定结果，而对于一整块MALDI 靶板样品如95个样品，仅需不到1小时即可获得结果。当时间对决策者至关重要时，拥有此技术可提高应对能力。

有关Q实验室的更多信息，请访问：https://www.qlaboratories.com/

有关Bruker的MALDI Biotyper的更多信息，请访问：https://www.bruker.com/applications/microbiology/food-beverage.html

关于作者：
Erin Crowley是Q实验室的首席科学官。她在Q实验室监督微生物实验室服务，是AOAC International会员。作为首席科学官，Erin在食品微生物学实验室的现代化、工作流程精简以及尽可能提高常规测试效率方面发挥了不可或缺的作用。

电子邮箱：ecrowley@qlaboratories.com

关于Q实验室

自1966年以来，Q实验室一直服务于食品、化妆品、制药、保健美容和膳食补充剂行业，提供全面的微生物学、化学实验室以及研发服务。作为一家将最先进的技术与个人服务和关注相结合的独立实验室，Q实验室可提供满足所有测试和质量保证需求的服务。Q实验室通过了ISO/IEC 17025认证，符合GMP/GLP标准，并在FDA注册，属MicroVal专家实验室，AOAC推荐实验室，AFNOR专家实验室，通过CDC ELITE水中军团菌检测认证，并由俄亥俄州环境保护局认证可进行饮用水微生物分析。实验室还积极参与AOAC和ISO以及IAFP等专业协会的指南和标准制定。

关于Bruker公司

50多年来，Bruker已帮助科研人员取得可提高人类生活品质的突破性发现，并开发出诸多新的应用。Bruker的高性能科研仪器和宝贵的分析解决方案，使科研人员得以在分子、细胞和微观水平上开展对生命和材料的探索。

通过与客户的密切合作，Bruker致力于帮助实现创新、生产力提升以及客户成功，领域涉及生命科学分子研究、制药应用、显微镜、纳米级分析、工业应用，以及细胞生物学、临床成像、临床研究、微生物学和分子诊断。更多信息，请访问：http://www.bruker.com