胶体金免疫层析技术快速检测谷物中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素

□贺丽丽 拜发分析系统销售(北京)有限公司

图1 RIDA®SMART APP读数仪

1971年，Faulk和Taylor首次将胶体金引入免疫化学领域，建立了以胶体金标记抗原(或抗体)检测相应抗体(或抗原)的免疫学新方法。自此，胶体金标记技术成为继荧光标记、酶标记和放射性免疫标记之后的又一新型免疫标记技术。经过近50年的发展，免疫胶体金标记技术已较为成熟，并被广泛应用于电镜水平研究、光显微细胞化学、免疫沉淀及蛋白质染色技术中。此外，这一技术还被引进免疫诊断/检测领域，并在医学检验、植物学诊断、刑侦、食品安全检测方面应用广泛。德国拜发生产的RIDA®QUICK系列就是利用胶体金免疫层析原理制备成胶体金免疫层析横流检测卡，结合德国拜发集团独有的RIDA®SMART APP读数仪，能对食品中存在的霉菌毒素进行准确定量检测。本文通过实验对德国拜发集团生产的RIDA®QUICK霉菌毒素系列在谷物、花生及花生粗榨油中的检测应用进行客观评价。

1 材料与方法

1.1 材料

RIDA®QUICK Aflatoxin RQS、RIDA®QUICK Zearalenon RQS、RIDA®QUICK DON及RIDA®SMART APP读数仪，均由德国拜发集团提供;用于添加回收实验的标准品为Trilogy®标准品，用于验证实验过程的参考物质为Trilogy®参考物质;用于配合HPLC高效液相色谱使用并进行比对试验的霉菌毒素免疫亲和柱为EASI-EXTRACT® AFLATOXIN、EASI-EXTRACT® ZEARALENONE、DONPREP®。以上所有材料均由德国拜发集团生产，购买自拜发分析系统销售(北京)有限公司。空白玉米粉基质，来源于国家粮食局科学研究院。

1.2 方法

单克隆抗体胶体金横流免疫层析法。

1.3 原理

本方法应用胶体金免疫层析原理。样品提取液中霉菌毒素与检测卡中报备的胶体金颗粒发生呈色反应，颜色深浅与样品中霉菌毒素的含量相关，用读数仪测定检测卡的颜色深浅，根据检测卡上检测带和质控带上的颜色饱和度对比，以及与读数仪内置曲线进行匹配拟合，自动计算出样品中霉菌毒素的含量。

1.4 样品处理方法

黄曲霉毒素：取10g代表性样品，加入70%的甲醇水溶液20mL，涡旋3分钟，离心或过滤。取上清用试剂盒中的缓冲液2倍稀释，混匀后作为样液备用。

玉米赤霉烯酮：取10g代表性样品，加入70%的甲醇水溶液20mL，涡旋3分钟，离心或过滤。取上清用试剂盒中的缓冲液6倍稀释，混匀后作为样液备用。

呕吐毒素：取4g代表性样品，加入60mL试剂盒中的水性提取液，涡旋3分钟，离心或过滤，取上清作为样液备用。

1.5 实验过程

将RIDA®QUICK系列试剂盒回温至20~23℃，取上层样液100μL，加入至检测卡的加样孔中，用检测卡自带的隔温除湿包装密闭其反应环境，静置5分钟后用RIDA®SMART APP读数仪进行读数。

2 结果

2.1 黄曲霉毒素及呕吐毒素胶体金免疫层析横流检测卡的准确度加标实验及精密度

2.1.1 准确度测定

胶体金免疫层析横流快速定量检测卡的准确度依据样本标定值的检测偏差来判定，随机抽取两个批次定量检测试剂盒进行检测，由3位实验人员分别进行加标，每位实验人员加标1份样本，总计3份平行加标样品，每人每份重复检测6次，共计54份样品，计算其平均值。计算方法：(检测均值-样本标定值)/样本标定值×100%。

2.1.2 精密度测定

精密度依据批内精密度和批间精密度两个方面来判定，批内精密度指同一批次产品检测同一样本结果的重现性，批间精密度指样本在不同批次产品检测同一样本结果的重现性，用变异系数(CV)表示。变异系数(CV)计算方法：变异系数(CV)=标准差/检测均值×100%。

2.1.3 准确度和精密度

见表1、表2。

2.2 玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析横流检测卡的准确度加标实验及精密度

分别测定玉米赤霉烯酮高、中、低(70μg/kg、125μg/kg、250μg/kg)3个浓度标准样品，每组做7份评价标准样品。由3位实验员按照所用产品提供的方法分别独立提取每组样品，并按照所用产品提供的方法检测，计算其标准差(SD)和检测均值。

2.2.1 准确度测定

准确度依据与标准样品标定值的检测偏差来判定，用回收率表示。回收率计算方法：检测均值/样本标定值×100%。

2.2.2 精密度测定

精密度依据批内精密度，指同一批次产品检测同一样本结果的重现性，用变异系数(CV)表示。变异系数(CV)计算方法：变异系数(CV)=标准差/检测均值×100%。

2.2.3 结果

见表3。

2.3 有证参考样及实际样品中黄曲霉毒素的检测

将有证参考样的中值作为参考准确值，样品既定真实值定值方法如下，黄曲霉毒素：国标GB 5009.22-2016第三法(黄曲霉的柱后衍生选取Kobra cell电化学柱后衍生法);呕吐毒素：国标GB 5009.111-2016第二法;玉米赤霉烯酮：GB 5009.209-2016第一法。偏离度计算：检测卡检测值/既定真实值×100%-100。

霉菌毒素实际样品检测卡与样品既定值的偏离度见图2、图3、图4。

3 讨论

通过不同的实验操作人、不同的实验样本及不同试剂盒批次的多次实验，验证了霉菌毒素检测系统的准确度、精密度及对实际样品检测的适用性，其回收率基本控制在80%~120%，变异系数小于15%。在实际样品检测中，产品检测值和国标方法检测值的偏离度控制在±20%范围之内，这说明，胶体金免疫层析横向检测卡准确度与精密度高，适用于实际样品的检测。

此类检测卡的设计原理中温度、湿度对其检测的准确度影响极大，如果此方面的因素没有控制好，那么其数值的变化区间可到50%~200%，导致实验结果不可信。本实验所用的检测卡设计精美、制作工艺精良，每个检测卡自带流速控制及保温除湿系统。这样可以屏蔽实验环境中的不利因素，在室外、室内，及我国的北方、南方的四季变换都可适用。同时，还避免了检测时因环境因素而导致的系统实验偏差，最大限度的发挥了检测卡的功效。

RIDA®SMART APP读数仪体积小，内置电源，内存可扩展至256G，可连接网络，且具备多种加锁形式。读数的形式为图像式，其报告信息包括检测时检测卡显示图像、实验人、试验时间、样品号码、样品检测值、试剂盒货号、批号、使用方法等信息，是优良的溯源数据库。无论在南方、北方的四季变换，还是白天、晚上，随时随地都可以准确读取检测卡的信息。

综上所述，该产品针对谷物及食品中的霉菌毒素检测值准确，整个实验的精密度好，可以用于谷物及其他样品中的霉菌毒素含量的现场筛查。

德国拜发集团所产的真菌毒素胶体金定量快检系统，符合粮油检测行业系列标准LST 6111-2015、LST 6112-2015、LST 6111-2015的要求。德国拜发集团通过了ISO 13485认证，保证该产品的生产环境与临床同类产品的生产环境一致;也通过了ISO 9001认证，保证产品批间、批内的稳定性及准确性达到标准要求。CBIFS 2019第十二届中国国际食品安全技术论坛将于4月11~12日在重庆举办，拜发将作为本次大会专题赞助商参展并发表主题演讲报告。在此，诚邀各位莅临拜发的展位(展位号71)参观指导，交流合作。