对市郊家养奶牛的鲜牛乳及自制酸乳和冰淇淋中金黄色葡萄球菌含量的检测与评估

□ 靳志敏 王燕 王茹 郑玉山 张宏博(通讯作者) 内蒙古自治区食品检验检测中心

摘　要：本文通过对内蒙古自治区呼和浩特市郊区普通农户的家养独立奶牛所产生鲜牛乳，以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黄色葡萄球菌的含量进行检测，判断其制品的质量是否合格。检测结果显示，呼和浩特市郊区普通农户的独立奶牛所产生鲜牛乳及自制酸乳、冰淇淋雪糕中金黄色葡萄球菌数量为0cfu/g，品质合格。

关键词：金黄色葡萄球菌 革兰氏染色实验 血浆凝固酶实验

1 引言

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起人类细菌性食物中毒及奶牛乳房炎症的重要细菌之一[1]。在显微镜下,金黄色葡萄球菌呈球状，直径约0.8μm，其细胞既没有芽孢也没有鞭毛，但少部分会有荚膜;在平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1~2mm。金黄色葡萄球菌的生长条件简单，可在没有水的条件下存活几周，属于需氧或兼性厌氧微生物，其在普通培养基上就可以生长，最适宜生长的pH值为7.4;最适生长温度为37℃，温度过高会使金黄色葡萄球菌死亡[2]。

金黄色葡萄球菌容易引发大规模食物中毒，在造成经济损失的同时产生严重的社会影响[3]。在乳及乳制品中，可能由于奶牛患有乳房炎症等原因而易发生金黄色葡萄球菌污染现象。所以本实验对内蒙古自治区呼和浩特市郊区普通农户的家养独立奶牛所产生鲜牛乳，以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黄色葡萄球菌的含量进行检测，判断其制品的质量是否合格。

2 材料与方法

2.1 样品

样品包括现挤生鲜牛乳(散装)、自制酸乳、自制冰淇淋3类，均来自内蒙古自治区呼和浩特周边旗县村散养养殖户家中，共计20户，地区分布如图1。样品冷冻或冷藏保存，且在8小时内送达实验室进行检验。

图1  呼市地区周边旗县采样分布图

实验选择样品作为实验组，将1mL金黄色葡萄球菌原液加入到25mL无菌水作为阳性对照组，无菌水为阴性对照组。

2.2 实验方法

2.2.1 检测方法

参考《国标食品微生物学检验金黄色葡萄球菌》GB 4789.10-2016对样品进行金黄色葡萄球菌检测。牛乳、自制酸奶各取25mL，冰淇淋雪糕则用电子天平取25g，将样品放入装有225mL 0.85%的氯化钠溶液均质袋中，均质1分钟后得到1:10的均匀样液。用移液器吸取制好的均匀样液1mL，加入至9mL氯化钠溶液的盐水管中，充分震荡，或用移液枪反复吸取，使其充分混匀后制成-2级样品匀液;重复上述步骤，将样品稀释到-4、-5、-6、-7级(每次吸取完上一级样品匀液后需更换移液器的枪头以防止梯度不准)。将稀释好的每一个梯度样品匀液吸取1mL，加入到接种量分别为0.3mL、0.3mL和0.4mL的B-P(Baird-Parker)平板中，加入后用无菌涂布棒涂布整个B-P板，涂布过程需防止将培养基刮破，注意不要碰到培养基边缘[4]。涂布过程中B-P板最好有一定余温，这样可以使样液被平板更好吸收。当B-P平板表面没有明显样液时，涂布完成;将平板静置10分钟后，倒置于36℃恒温培养箱中培养48h，然后取出观察是否有菌落生长。若有数据，需保存好数据并准备灭菌杀毒;若没有，可直接放入生物垃圾袋等待灭菌杀毒。

2.2.2 验证方法

在观察过程中若有典型的金黄色葡萄球菌落生成则要进行验证实验。

①革兰氏染色实验：利用已经制好的结晶紫溶液、革兰氏碘液以及沙黄对在B-P板上长出的典型菌落进行染色。首先将典型的菌落制成涂片放到显微镜上，滴几滴结晶紫溶液，一分钟后用水洗掉;然后滴加革兰氏碘液，让其在涂片上停留作用一分钟后水洗[5];接着用乙醇进行褪色处理，一般30秒即可，直到完全洗掉，但不能太过脱色，之后用水清洗;最后，滴加上沙黄复染液，约一分钟后水洗，晾干后进行镜检[6]。

②血浆凝固酶实验：将每个长菌B-P平板上典型的金黄色葡萄球菌菌落都接到BHI与营养琼脂的小斜面试管中，在37℃下培养18h。将冻干兔血浆加水溶解后，向瓶中加入0.3mL培养过的BHI(脑心浸出液肉汤)，充分震荡，放在36℃下培养，每隔半个小时观察一次，并持续观察6个小时，如果有凝固或者凝固的体积比原来的体积大一半，则可以判断为阳性的结果，菌落为金黄色葡萄球菌[7]。

若对结果还存有疑虑，可挑选经过小斜面培养的金黄色葡萄球菌菌落于BHI中，在37℃下培养18h，再次重复上述过程。

3 结果与分析

3.1 检测结果

实验组中生鲜牛乳在36℃下培养48小时后，结果如表1所示(因为样品实验后结果完全相同，故只取其中5组数据举例分析，下同)，菌落数量为0cfu/g，且由图2可以看出B-P板上未出现金黄色葡萄球菌菌落，表明检测的样品均品质合格。

实验组中，自制酸奶在36℃下培养48小时后，结果如表2所示，菌落数量为0cfu/g，且由图3可以看出B-P板上未出现金黄色葡萄球菌菌落，表明检测的样品均品质合格。

实验组中，冰淇淋雪糕于36℃下培养48小时后，结果如表3所示，菌落数量为0cfu/g，且由图4可以看出B-P板上未出现金黄色葡萄球菌菌落，表明检测样品的品质均合格。

阳性对照组实验中，B-P板上有菌落生长如图5所示，结果如表4。经计算，金黄色葡萄球菌数量为4.9×108cfu/g。

阴性对照组中，由图6可以看出B-P平板没有金黄色葡萄球菌菌落生成，结果如表5，证明实验没有被污染，实验成功。

3.2验证结果

对阳性对照组B-P板上的菌落进行革兰氏染色实验，染色实验现象如图7所示，排列呈葡萄球状、无芽胞、无荚膜、直径约为0.5~1μm。验证该微生物为金黄色葡萄球菌，验证成功。

将B-P板上生长出的黑色小点沾取一点，然后在营养琼脂小斜面轻轻上划线，培养后均如图8所示，图中透明无色的部分为生长出的菌落，验证成功，黑色小点是一种微生物菌落。

将B-P板上长出的菌加入到BHI培养液做血浆凝固酶实验，本次血浆凝固酶实验均用冻干兔血浆，加500mL无菌水溶解后加入0.3mL的BHI培养液，血浆凝固酶实验结果如图9所示，图中左侧为金黄色葡萄球菌阳性菌，右侧为阴性对照实验，左侧瓶中出现凝固，结果为阳性，表明该微生物为金黄色葡萄球菌。

4 结论

本实验对呼和浩特市郊区普通农户的家养独立奶牛所产生鲜牛乳以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黄色葡萄球菌进行检测，结果显示，3种自制产品中金黄色葡萄球菌的菌落数为0cfu/g，表明产品中均不含有金黄色葡萄球菌，品质合格。

本次实验对呼和浩特市市郊20户散养养殖户的生鲜牛乳及乳制品的检测中未发现金黄色葡萄球菌，说明呼市散养养殖户家生产的生鲜牛乳及乳制品符合食品安全规范。但是由于样本量较少，仍不足以说明全部地区都符合安全标准。对于金黄色葡萄球菌的检测是必不可少的，企业和监管部门一定要足够重视食品安全，并时刻关注金黄色葡萄球菌的检测发展。

参考文献：

[1] 陈丙卿，王茂起.现代食品卫生学[M].北京:人民卫生出版社，2001，757-758.

[2] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社，2001，246-247.

[3] Post. D.E Food pathogens(Staphylococcus aureus)[J].Monograph number 6. England.

[4] 张颖.金黄色葡萄球菌快速检测方法的研究进展[J].中国动物保健，2014，(6):17-19.

[5] 谢范英.食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法比较研究[J].现代商贸工业，2014，(17):197-198.

[6] 黄岭芳，赖卫华，张莉莉.食品中金黄色葡萄球菌快速检测方法的研究进展[J].食品与机械，2009，(6):181-185.

[7] GB 4789.10-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验[S].