摘　要：以蛹虫草子实体为原料，研究索氏法提取工艺，提取蛹虫草子实体多糖。通过单因素试验和正交试验方法探讨乙醇的浓度、固液比、提取时间对多糖提取率的影响，建立了最佳的工艺参数，即50 %乙醇，固液比1:50，提取时间4h，此时多糖平均提取收率为10.86%。

关键词：蛹虫草  索氏提取  多糖

    蛹虫草[Cordryceps miltaris（L.ex.Fr）Link]属于子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科，虫草属真菌的模式种，又名北虫草、北冬虫夏草，其由子座和菌核（即虫或蛹的尸体）两部分组成^[1-2]。传统中医理论认为，虫草入肺肾二经，既能补肺滋阴，又能补肾壮阳，故能同时平衡、调节阴阳^[3]。现代医学研究表明，北冬虫夏草富含蛋白质、维生素、磷、钙、铁、锰、锌、硒等微量元素，以及虫草多糖、虫草素、虫草酸、超氧化物歧化酶、腺苷等生物活性物质^[4]。虫草多糖作为北冬虫夏草重要的生理活性物质之一，具有抗肿瘤、降血糖、抗辐射、抗病毒等活性，能显著增强机体免疫力，具有良好的应用前景^[5-6]。目前,人们对于虫草的研究已经从简单的发酵培养得到菌丝体，进入到对其成分的分子水平、基因水平和应用开发的研究方面。对于虫草多糖，在通过大规模发酵得到虫草菌丝体后对于多糖的提取已成为下一步研究和应用的关键及中间环节。传统的虫草多糖提取方法采用浸煮法，提取率在料液比相同时受浓度梯度的限制。而采用索氏法提取，由于在提取过程中蛹虫草不断被纯溶剂萃取，因此不仅可以提高有效成分的获得率，而且溶剂被反复利用，节约了用量。本研究采取单因素分析法和多因素正交分析法对索氏法提取虫草多糖工艺进行优化，旨在建立一种稳定、快速、高效的虫草多糖的索氏提取法。
 
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.1.1 试剂：无水乙醇，浓硫酸，苯酚，葡萄糖，均为分析纯。
    1.1.2 材料：蛹虫草子实体，新会特产。
    1.1.3 器材用具：高速粉碎机，电子恒温水浴锅，电热鼓风干燥箱，电子天平，索氏提取器，722型光栅分光光度计。
    1.2 方法
    1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制
    1.2.1.1 苯酚溶液配制：称取苯酚（分析纯）5.00g，加100mL蒸馏水，配成5%溶液，装棕色瓶中备用。
    1.2.1.2 葡萄糖标准溶液配制：准确称取葡萄糖200mg，置于100mL容量瓶中，定容摇匀，取1mL于50mL容量瓶中定容摇匀，为含葡萄糖40mg/L的标准溶液。然后吸取葡萄糖标准溶液0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL，用蒸馏水补充至2.0mL，加入5%的苯酚溶液1.0mL摇匀，浓硫酸5.0mL，充分摇匀后放置5min，置于沸水浴中加热15min，取出冷却至室温。另取蒸馏水2.0mL，加苯酚、浓硫酸同法操作为一空白对照，于490nm处测定吸光度值，以吸光值A和葡萄糖浓度C计算回归方程。
    1.2.2 虫草多糖的提取
    将虫草子实体置于电热鼓风干燥箱中于75℃干燥至恒重，然后用高速粉碎机粉碎。精确称取样品2.00g，取100mL无水乙醇，用索氏提取器于90℃水浴箱中提取4h，然后称取1%的活性炭脱色1h^[7]，过滤，定容至250mL容量瓶中，取10mL提取液稀释至100mL容量瓶中，备用。
    1.2.3 苯酚-硫酸法^[8]测定样品中多糖
    精密吸取样品处理液2.0mL，置于10mL比色管中，加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速加硫酸5.0mL，摇匀，放置15min，于490nm处测吸光度值，以标准曲线计算样品多糖的含量。
    1.2.4 提取率的计算
    多糖提取率＝测得的多糖含量/蛹虫草粉末质量×100%。
    1.2.5 乙醇浓度对多糖提取率的影响
分别用20%、40%、60%、80%的乙醇溶液和无水乙醇，控制料液比1:50(g/mL)，按1.2.2提取和1.2.3测定其多糖提取率。
    1.2.6 料液比对多糖提取率的影响
分别控制料液比为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)，使用40 %的乙醇溶液，按1.2.2提取和1.2.3测定其多糖的提取率。
    1.2.7 提取时间对多糖提取率的影响
分别控制索氏提取时间2h、3h、4h、5h、6h，使用40%乙醇溶液，料液比为1:50(g/mL)，按1.2.2提取和1.2.3测定其多糖提取率。
    1.2.8 索氏法提取蛹虫草多糖的正交实验
    在索氏法提取蛹虫草子实体多糖的单因素实验基础上，利用L9（33）正交试验法研究索氏提取法中的三个主要因素，即A（乙醇浓度）、B（料液比）、C（提取时间）对虫草多糖的提取的影响，以确定最佳提取条件，因素水平见表1。     2.3 料液比对多糖提取率的影响
    料液比对蛹虫草多糖提取率的影响如图2所示。由图可见，随着料液比的增加，即虫草多糖提取率随溶剂增加而增加，当料液比达到1:50时，提取率最高，此后料液比继续增加时提取率逐渐下降。因此，正交实验设计料液比选择1:45、1:50、1:55三个水平。
2 结果与分析
    2.1 葡萄糖标准曲线测定结果
    在波长490nm处测定吸光度值，以葡萄糖浓度c为横坐标（mg/L），吸光度A为纵坐标，绘制葡萄糖含量与吸光度的标准曲线，得回归方程为：A=0.0156c-0.0114，相关系数r²=0.9991，线性关系良好。
 
    2.2 乙醇浓度对多糖提取率的影响

    乙醇浓度对蛹虫草多糖提取率的影响如图1所示。由图可见，当乙醇浓度小于40%时，多糖的提取率随着乙醇浓度的增大而增加；当乙醇浓度达到40%时，多糖提取率达到最高，此后随着乙醇浓度的进一步增加，多糖提取率逐渐降低。因此，正交实验设计乙醇浓度选择30%、40%、50%三个水平。
    2.3 料液比对多糖提取率的影响

    料液比对蛹虫草多糖提取率的影响如图2所示。由图可见，随着料液比的增加，即虫草多糖提取率随溶剂增加而增加，当料液比达到1:50时，提取率最高，此后料液比继续增加时提取率逐渐下降。因此，正交实验设计料液比选择1:45、1:50、1:55三个水平。
    2.4 提取时间对多糖提取率的影响

    提取时间对蛹虫草多糖提取率的影响如图3所示。由图可见，多糖提取率随提取时间的延长而增加，当提取时间达到4h以后，时间进一步延长,提取率增加缓慢。因此，正交实验设计提取时间选择为3.5h、4h、4.5h三个水平。
    2.5 索氏法提取蛹虫草多糖工艺条件正交试验结果     从表2的试验结果极差分析可知，3个考察因素的极差大小顺序为：A（乙醇浓度）＞C（提取时间）＞B（料液比），说明乙醇浓度对多糖提取率的影响最大，提取时间的影响最小；最优方案为A3B2C2，即乙醇浓度50%、料液比1:50、提取时间4h。
    2.6 最优参数组合验证
    由于所得到的最优工艺参数组合不在正交实验设计的9组内，因此在正交实验最优组合A3B2C2的工艺参数条件下，进行3次平行验证实验，结果见表3，多糖平均提取率为10.86%，高于正交实验的9组技术组合，且提取结果稳定。 3 结论
    本研究以蛹虫草子实体为材料，研究索氏法提取虫草多糖的工艺条件，探讨乙醇浓度、固液比、提取时间对多糖提取率的影响，通过单因素试验和正交试验建立了最佳提取工艺参数，即50%乙醇、固液比1:50、提取时间4h，此时多糖平均提取收率为10.86%。
参考文献：
[1] 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编（上册）[M].北京：人民卫生出版社，1992：237-240.
[2] 汤晓赟，丁选胜.蛹草的研究进展[J].基层中药杂志，2002，16（4）：50-53.
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[4] 王建芳，杨春清.蛹虫草有效成分及药理作用研究进展[J].中医药信息，2005，22（5）：30-32.
[5] 陈贵宝，罗梅初，刘实晶.蛹虫草的药理作用研究[J].中草药，1997，28（7）：415-417.
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广东省科技计划项目，项目编号：2017A070701039。