摘　要：目的是验证贵州勤邦食品安全科学技术有限公生产的阿维菌素ELISA检测试剂盒的检测效果，采用酶联免疫法对鸡肉和鸡肝样品中阿维菌素的残留量进行检测，并与高效液相色谱-质谱法进行对照。结果显示，该试剂盒对两种样品的最低检测限分别为0.516μg/L、0.609μg/L，试剂盒板内板间变异系数均小于10%；对两种样品做加标回收试验，其回收率均在95%~120%之间，变异系数均小于10%；该方法与仪器检测方法检测实际样品的阴、阳性判断结果一致。结论为该方法稳定、可靠，可满足食品中阿维菌素残留快速检测的需要。

关键词：酶联免疫  阿维菌素  检测  鸡肉  试剂盒

    阿维菌素类药物是一种被广泛使用的农用或兽用杀菌、杀虫、杀螨剂，属于大环内脂类抗生素，其作为一种抗寄生虫药物而被广泛应用。刘耀川等人对阿维菌素的组成、化学结构、作用机制、不良反应等基础性质进行了研究^[1]。作为一种毒性化合物，阿维菌素类药物在动植物中的危害也逐渐得到重视，当前主要的检测手段有微生物法、仪器检测法、免疫分析法等^[2-6]。由于仪器分析法的样本前处理及测定操作繁琐且费用高，其推广使用受到限制；而微生物法也存在检测周期长、检测精度低等缺陷。酶联免疫法可弥补以上两种方法存在的缺陷，兼具操作便捷、精度高、经济、可批量检测等优点，应用前景广阔。
    本实验采用酶联免疫法对鸡肉、鸡肝中阿维菌素类药物的检测效果进行研究，并对比仪器检测结果以进一步验证公司自主研究的阿维菌素ELISA试剂盒的检测效果，从而为鸡肉的快速、精准检测提供高效的检测途径。
 
1材料及设备
    材料：阿维菌素ELISA检测试剂盒（自主研发），其中含有：96孔酶标板、标准品6瓶（0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L，1mL/瓶）、高浓度标准品（1μg/mL，1mL/瓶）、酶标二抗、抗体工作液、底物A液、底物B液、终止液、20×浓缩洗涤液、2×浓缩复溶液；鸡肉、鸡肝样品（市售，购自贵阳小河沃尔玛超市）；甲醇（分析纯）、乙腈（分析纯）、无水硫酸钠（分析纯）、sep-pak vac12cc（2g）柱（组织样本方法-使用）、碱性氧化铝（100~200目,分析纯）、正己烷（分析纯）、去离子水。
设备：微孔板酶标仪（450/630nm）、旋转蒸发仪/氮气吹干装置、均质器、振荡器、涡旋仪、离心机、天平（感量0.01g）、刻度移液管（10mL）、聚苯乙烯离心管（2mL、50mL）、玻璃试管（10mL）、微量移液器（单道：20~200μL、100~1000μL，多道：250μL）。
2 方法
    2.1 溶液配制
    配液1：复溶工作液。用去离子水将2×浓缩复溶液按1:1体积比例进行稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶工作液在4℃环境中可保存一个月。
    配液2：洗涤工作液。用去离子水将20×浓缩洗涤液按1:19的体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境中可保存一个月。
    2.2 样本前处理
    将鸡肉、鸡肝切碎后用均质器均质，称取5.0±0.05g均质后的样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入10mL甲醇，涡旋仪涡动1min，再用振荡器震荡，以3000r/min的转速离心10min；移取20μL上清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入复溶工作液，按1:9体积比进行稀释（20μL样本+18μL复溶工作液）；取20μL用于分析。
    2.3 试验步骤
    ①将所有试剂取出回温，使用前摇匀。
    ②取出所需数量的微孔板。
    ③编号：将样本和标准品对微孔按序编号，每个样本和标准品做2个平行，并记录标准孔和样本孔所在位置。
    ④加标准品/样本和抗体工作液：加标准品/样本20μL至对应微孔中，然后加抗体工作液80μL/孔，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后,置于37℃环境下避光反应30min。
    ⑤洗板：揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。
    ⑥加酶标二抗：加入酶标二抗100μL/孔，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光反应30min，取出后重复洗板步骤。
    ⑦显色：加入底物液A液50μL/孔，再加入底物液B液50μL/孔，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置于37℃避光显色15min。
    ⑧测定：加入终止液50μL/孔，轻轻震荡混匀，设定酶标仪在450nm处测定OD值。
    2.4 阿维菌素浓度的计算
    标准品或样品百分吸光率等于标准品或样品吸光度值的平均值除以第一个标准品(0μg/L)吸光度值的平均值，再乘以100%，即百分吸光率(%)=B/B₀×100%（B为标准品或样品溶液的平均吸光度值，B₀为0μg/L标准溶液的平均吸光度值）。
    将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应浓度，乘以其对应稀释倍数即为样品中阿维菌素实际浓度。
    2.5 试剂盒相关指标检测方法
    分别对试剂盒的灵敏度、准确度、精密度进行试验，并将灵敏度、精密度和准确度与HPLC检测的灵敏度、精密度和准确度进行对比。
    2.5.1 试剂盒灵敏度测定方法
    分别对20份空白鸡肉、鸡肝样品进行检测，计算阿维菌素浓度，以20份品中阿维菌素浓度的平均值(   )和标准差(S)来表示检测限(LOD)，即：

    式中：X为实验重复测定空白样品的平均值；n为实验测定样品的数量。
    2.5.2 试剂盒精密度测定方法
    取10个试剂盒，每盒随机取1块酶标板，每块酶标板中随机抽取20个微孔，测定4.5μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。
    2.5.3 样品准确度和精密度测定方法
向空白样品中加入阿维菌素标准品，使鸡肉中阿维菌素终浓度为10、20、30μg/L，鸡肝中阿维菌素终浓度为15、   25、35μg/L，每种样品、每个浓度均做5个平行，按2.4操作方法进行测定，分别计算板内、板间变异系数及回收率。
    2.6 仪器测定方法
    参照国标GB/T 23200.20-2016^[7]。
3 结果分析
    3.1 标准曲线的绘制
    标准品的浓度为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L，分别测得其吸光度值为2.043、1.362、0.997、0.683、0.346、0.055，绘制标准曲线如图1，可知，标准曲线方程为：Y=-33.49X+55.58，R²=0.998。     3.2 试剂盒灵敏度测定结果
    参按照2.4的方法，得到阿维菌素试剂盒检测鸡肉、鸡肝样品的检测限如表1，可知，该试剂盒对鸡肉、鸡肝几种样品的最低检测限分别为0.516μg/L、0.609μg/L，远低于国家标准中鸡肉和鸡肝产品中0.01μg/mL的最低限量要求。     3.3 试剂盒精密度测定结果
    由表2可知，阿维菌素试剂盒的板内、板间变异系数在5%~8%之间，均小于10%，说明该试剂盒重现性好，性能较为稳定。      3.4 试剂盒准确度测定结果
    向鸡肉、鸡肝两种空白样品中分别添加不同浓度的阿维菌素，每个浓度各5个平行，同时做空白对照，按2.4操作方法测定。分别计算标准偏差及回收率，从表3可知，4种样品回收率均在95%~120%之间，变异系数均小于10%，符合《农业部文件》农医发[2005]17号附件2中试剂盒备案参考证券标准中第4点关于精密度和准确度的规定，说明该阿维菌素检测试剂盒精密度良好。      3.5 与仪器对比测定结果
    3.5.1 灵敏度比较
    随机抽取市售鸡肉和鸡肝样品各5份，分别用ELISA试剂盒和高效液相色谱测定样品中阿维菌素的残留量，由表4可知，ELISA试剂盒检测结果与仪器检测结果复核率为100%，说明ELISA检测试剂盒灵敏度较高；检测的20个样品中三聚氰胺残留量均未超标，合格率达到100%，说明相关部门已经加大对食品安全监管力度，违法现象大大减少，保障了人民食品安全和健康。     3.5.2 准确度和精密度比较
    在同等条件下，对空白鸡肉样品做阿维菌素添加量为20μg/L的添加回收试验(其中，ELISA试剂盒检测方法中，随机选取3块酶标板，每块板做4个平行)，比较ELISA试剂盒和高效液相色谱法回收率和变异系数。由表5可知，仪器检测方法的回收率在96.78%~105.38%，平均回收率为99.32%，变异系数为4.12%；两次平行试验，ELISA试剂盒的回收率在97.78%~109.98%之间，平均回收率为102.19%，试剂盒板间变异系数为3.74%；ELISA法和HPLC法测定结果基本一致，符合度基本达到100％，适用于鸡肉中阿维菌素的残留检测。 4 结论
    本研究采用酶联免疫法对鸡肉、鸡肝中阿维菌素残留量进行检测，通过与仪器检测方法做对照，验证本公司自主研发的阿维菌素ELISA检测试剂盒的检测效果。结果表明，阿维菌素ELISA检测试剂盒检测灵敏度较高，对鸡肉、鸡肝样品最低检测限较低，远低于国家规定最高残留量；与高效液相-质谱检测法相比，检测结果一致，且试剂盒检测用时短(30min)、样品前处理方法简单、操作简单、投入少、耗能低，可满足对鸡肉等样品中残留阿维菌素的快速检测。
参考文献：
[1] 刘耀川，赵刚，宁静等.阿维菌素的研究进展[J].现代畜牧兽医，2012(01):60-62.
[2] 郑岚，王梅，段劲升等.阿维菌素类农药的残留研究综述[J].现代农业科技，2011(11):169-170.
[3] 王海，刘素英，单吉浩等.液相色谱法测定猪组织中阿维菌素类药物残留量[J].中国兽药杂志，2005，39(9)12-15.
[4] 周俊，乔坤云，冯婷等.牛猪肉中伊维菌素残留量
的HPLC检测与分析[J].现代科学仪器，2005，(1)82-83.
[5] 高国文.高效液相色谱法检测大白菜中阿维菌素残留量，农药科学与管理，2005，26(11):8-9.
[6] 张少华，皇甫伟国，何新华等.高效液相色谱法检测葱中阿维菌素的残留量，药，2006，45(4):362-364.
[7] GB 23200.20-2016食品中阿维菌素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法.
基金项目：2017年贵州省工业和信息化发展专项资金计划（项目名称：技术中心创新能力建设（2017002））；2016年贵阳市经济技术开发区科学技术计划项目（项目名称：磺胺类、阿维菌素类药物快速检测实际开发及产业化）；2016年贵州省技术创新项目（项目名称：慢抗快速检测试剂盒产业化）；2016年贵州省科技厅社会攻关计划项目（项目编号：黔科合[2016]支撑2908号）、2017年贵州省科技支撑项目（项目编号：黔科合支撑[2017]2034）、贵阳市2016年人才创新创业资助项目（项目编号:筑人才办合同字[2016]第13号）。