食品微生物快速检测技术研究

2018-04-24 13:23:58 来源：食品安全导刊

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　　为保障食品安全，减少食源性疾病的发生，食源性致病菌的检测显得尤为关键。传统的微生物检验方法主要基于培养法，一般流程为：样品均质，增菌，选择性分离，生化鉴定及血清学鉴定。其优点是灵敏度高、价格低廉、容易操作，缺点是劳动量大且检验周期长。随着技术的发展，无需增菌，直接检测食品样品中低浓度的致病菌已成为可能。这些不依赖于培养、新型、快速的检测技术可以有效分离、聚集和鉴别致病菌，从而缩减了整个检验周期。

　　核酸检测技术

　　基于PCR的检测技术

　　普通PCR PCR技术被广泛用于各类食品中致病菌及毒素的检测。介于食品基质的影响，常需离心或磁珠法预处理将致病菌从食品中分离。也有研究使用金属氢氧化物进行微生物的富集分离，Taylor等人使用氢氧化钛从碎牛肉中分离E.coli O157:H7后，通过对志贺毒素基因II的扩增进行检测。

　　多重PCR多重PCR是在一个反应体系中使用多对引物同时进行多个目标扩增的PCR反应，可同时检出多种病原微生物，比普通PCR更加高效、经济、便捷。使用此技术，需要对多对引物进行精心设计，以使其具有相近的退火温度。每对引物的浓度需要调整优化，否则可能导致引物二聚体生成和非目标片段扩增。

　　实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（qPCR）是利用荧光信号的变化，实时监测PCR反应过程中DNA扩增产物的方法。使用该方法，无需电泳或进行其他后续分析。最早的qPCR使用SYBR Green荧光染料进行荧光信号的测定，此外还有TaqMan探针法、分子信标法，他们在准确性、特异性方面要优于染料法。

　　实时定量反转录PCR实时定量反转录PCR（RT-qPCR）也可实时监测扩增的目标产物，它先以RNA为模板反转录cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应。RT-qPCR灵敏度较高，样品制备或扩增条件的细微差异都可能影响结果。由于RNA在胞外极易降解，故RT-qPCR优势在于仅活细胞的RNA被提取，结果假阳性率较低。

　　非PCR核酸检测技术

　　环介导等温扩增环介导等温扩增法(LAMP)是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(59-65℃)保温30～60分钟，即可完成扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环等过程，检测成本低。LAMP特异性强、灵敏度高，其1小时内的扩增产物量可以高出普通PCR的103倍。

　　核酸依赖性扩增检测技术核酸依赖性扩增检测技术（NASBA）是一项以RNA模板进行等温核酸扩增并能实时监测结果的检测方法。该技术的检测反应有赖于AMV逆转录酶、噬菌体T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。有研究者使用NASBA技术进行牛奶中金黄色葡萄球菌，检出限分别为1～10cfu/mL。

　　基因芯片基因芯片是一块载有许多短小DNA探针的特殊玻璃片，探针与目标微生物的标记基因互补，大小在25～80bp之间。先提取目标微生物的DNA，进行荧光标记、变性后与芯片上的探针进行杂交，形成的双链DNA释放荧光信号，从而得到检测。

　　微流体芯片微流体技术是指在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的技术，被称为“芯片实验室”或“微整合分析芯片”，可将样品制备、生化反应、结果检测等步骤集成到生物芯片上，实验所用流体的量可低至纳升或皮升级。Zhang等人使用微流体芯片检测了面包、牛奶和香蕉中的鼠伤寒沙门氏菌等3种菌的检测，检测时间仅用了14min。

　　免疫学方法

　　酶联免疫法ELISA酶联免疫法ELISA是应用最广泛的致病菌检测方法之一。近期该方法的研究进展集中在如何提高抗体的密度以提高方法的灵敏度或新抗体的开发等。Chunglok等人使用单层的碳纳米管作为抗固定化载体，检测了牛奶中的鼠伤寒沙门氏菌，检出限比其他免疫学方法低了2个log值。

　　侧向流免疫层析侧向流层析技术以大孔径的微孔滤膜为载体，先将特异性的抗原或抗体固定在滤膜上，样品通过时发生特异性免疫反应，用免疫胶金体或免疫酶染色得到直观的显色结果。此技术的优点是成本低、稳定性好、技术难度小、检验时间短等，可用于高通量样品筛选，但假阳性率比ELISA和PCR高。

　　生物传感器常见的用于检测致病菌的生物传感器包括光学传感器、电化学传感器、压电式传感器、磁弹性传感器。近些年，生物传感器的灵敏度、特异性和速率不断提升，但依然存在重现性差和现场检测应用方面的问题，新的传导材料的开发，多重检测、微流体技术与传感器的耦合，及无线设备的研发等将是这一领域的发展方向。

　　随着技术的发展，许多新型、快速的致病菌检测方法得到了开发和应用。核酸检测技术的检测快速、专一性强，可重复使用，所需DNA样本量少，qPCR、LAMP和NASBA是其中的重要检测技术。ELISA和LFI技术无需提取DNA步骤，但灵敏度有待提高，多重检测和自动化操控也在研究之中。生物传感器分析迅速、操作简单，不同的传感元件、传导技术被开发用于食品致病菌的检测。这些方法作为传统方法的替代性方法，大大缩减了检验周期。高效快速分离方法的研究、特异性探针的开发，以及对新方法进行综合性的验证能够促进这些技术更成熟的发展。

　　李璐太原市食品药品检验所