电极式食用油过氧化值试纸的研制

2018-03-27 12:23:35 来源：食品安全导刊

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　　目前我国各防疫部门检测食用油过氧化值大多按照GB/T5009.37-1996规定的分析方法（化学滴定法）。针对实验室检测对设备和技术要求较高、耗时长，市场上已经有过氧化值快速检测产品，过氧化值速测卡，可以方便使用。已有采用碘化钾淀粉法研制过氧化氢检测试纸的报道，但研制出的试纸检测灵敏度较低，而且检测结果如不立即观察，受空气氧化作用等影响，反应物颜色很快发生变化，对光和氧敏感，易失效；反应时间长，超过5分钟；只能定性和半定量测量不能对结果进行正确判断。

　　材料与方法

　　试剂辣根过氧化物酶(HRP)、3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)购于Sigma公司、羧甲基纤维素、气化二氧化硅、柠檬酸、柠檬酸钠均购于Alfaaesar公司。PET基片购置于杜邦公司，导电油墨、绝缘油墨均购于美国Acheson公司。

　　方法原理样品中的过氧化物在辣根过氧化物酶的催化下与TMB反应，反应过程中会产生微弱电流，由配套的仪器内置仪表测量电流变化并换算显示为相对应的过氧化值。

　　电极式过氧化值试纸制作首先，采用丝网印刷技术在0.25mm厚PET塑料基片上制作工作电极、参比电极和短路电极，工作电极、参比电极和短路电极，采用由Acheson公司购买的导电碳墨制作。通过丝网印刷将导电油墨在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到80℃烘箱中烘干60min。其次，采用丝网印刷技术在印好电极系统的基片上印刷绝缘漆作为电绝缘隔离层，绝缘漆由Acheson公司购买。通过丝网印刷将绝缘漆在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到紫外烘干机一分钟烘干。最后，在电极表面固定酶反应膜用于过氧化值的检测。取4µL酶反应液滴加到电极表面，50℃烘干20min，备用。

　　样品食用油过氧化值检测将样品与萃取液按1:1混合，搅拌均匀，静置2分钟，作为待测溶液。将上述待测溶液滴加到电极式过氧化值试纸的加样口，样品通过毛细作用自动吸到电极式过氧化值试纸反应区，反应区电极上HRP催化过氧化物发生氧化还原反应，放出电子，电子再与的3，3，5，5-四甲基联苯胺反应，生成传电子络合物，电子在传感器检测仪的恒定电压激励下发生定向移动形成电流，电流被转换及放大后经过模数转换器之后，由单片机将电信号转换成过氧化值浓度直接从液晶显示其读数，同时还将数据存储在存储器中。

　　试纸检测准确性测试按已确定最佳TMB、辣根过氧化物酶量配方，制作试纸。用制作的试纸测试过氧化值为5meq/kg、10meq/kg、15meq/kg、20meq/kg、25meq/kg、50meq/kg样品，样品用国标滴定法滴定，做图，得到线性相关图。

　　试纸稳定性测试将试纸分成10瓶，五瓶常温保存，五瓶放在60℃烘箱。到时间后，用试纸检测滴定法定值的样品，比较测试值与滴定法定值的偏差，以确定试纸保存期。

　　结果与分析

　　试纸制作试纸制作采用丝网印刷方法制作电路，先印刷导电层油墨，烘干后，再印刷绝缘层油墨。由于电路图形通过网版印制到PET，一次可以印刷200片试纸的图形，使用印刷机印刷电路，每分钟可以形成几千片试纸的图形；采用自动化滴液机将酶液滴到试纸电极上，液体量可以控制，保证负载在试纸电极上的酶量均一，测试精度高；试纸制作工序均为半自动机器或自动设备，适合大批量生产。

　　酶试剂中TMB含量确定试纸中TMB作为电化学介质，在反应中起到重要作用，它的量与反应速度有密切关系。在一定范围内，TMB的量越高，线性越好，反应越灵敏。但是，TMB通常难溶于水，易溶于有机溶剂，本研究使用水溶性TMB。水溶性TMB在水中的溶解度也不是很大。因此，TMB的使用量既要考虑反应性，也要考虑溶解性。试验中，当浓度达到0.5%时，测试过氧化值5meq/kg-50meq/kg油样，线性很好。当浓度大于0.5%，斜率没有明显变大，只是截距变大了，线性没有明显改变，但是TMB已经有点难溶解了，但用量为1%时，明显看到TMB溶解不完全。因此，试纸酶液中的最佳TMB浓度确定为0.5%。

　　酶试剂中过氧化物酶含量确定过氧化物酶含量低时，反应速度慢，测试电流较低，过氧化物酶含量高时，反应速度加快，测试电流变大，在一定范围内，过氧化物酶的量越高，线性越好，反应越灵敏。但是，当浓度达到0.8%，即使再加多量，电流也没有增大，说明酶量已经足够了。因此，试纸酶液中的最佳TMB浓度确定为0.8%。

　　试纸检测准确性测试将样品与萃取液按1:1混合，搅拌均匀，静置2分钟，作为待测溶液。将上述待测溶液滴加到电极式过氧化值试纸的加样口，样品通过毛细作用自动吸到电极式过氧化值试纸反应区，5秒钟显示结果，记录结果，每个浓度重复测十次，计算平均值。电化学过氧化值试纸测试值与滴定法测试值相关系数为0.9887，具有很好相关性，可用于临床。

　　本研究根据电化学生物传感器原理，利用丝网印刷技术制作电路，使用点喷方法将酶液固定在试纸电极上，制作用于食用油中过氧化值检测的电化学试纸。该试纸可在5s内对样品进行定量检测，最低检测极限为5meq/kg，试纸保质期为12个月。该试纸重复性好，反应灵敏，检测时间短，只需5秒，样品处理方法简单，而且抗干扰能力较强，可以大批量生产，在食用油过氧化值的现场快速检测领域将有很好的应用前景。

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