动物源性食品鸭血中鸭成分普通PCR检测方法探究

2018-03-27 12:17:52 来源：食品安全导刊

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　　摘要：研究鸭血因DNA部分降解而使普通PCR检测结果偏离的优化方法。对普通PCR方法未检出但实时荧光定量PCR方法检出的鸭血DNA通过增加扩增模板量到5uL，扩增产物稀释100倍进行二次扩增，可以得到的DNA纯度较高，凝胶电泳条带明亮，背景清晰，改进的方法能使普通PCR方法检测结果准确性提高，降低假阴性概率。

　　关键词：鸭血，普通PCR检测，假阴性，鸭血DNA，二次扩增

　　鸭血的营养价值很高，含有丰富的蛋白质、多种微量元素（如铁、铜、钙等），有补血和清热解毒的作用，并有预防和治疗缺铁性贫血的功效。鉴于如此的食用功效，且鸭血液量相对于体积庞大的动物血量相对较少，因此鸭血的价格明显偏高，部分商家为了盈利可能会在鸭血中掺杂猪血甚至其他动物血来销售。以DNA为基础的PCR技术广泛被用来鉴定食品中的动物源性成分[1]，由于血液保质期短，在加工制作的过程中会加入盐和凝固剂[2]等化学物质，加之在提取鸭血DNA过程中的物理作用等会对DNA造成破坏，使DNA含量降低而使检测结果有偏差。

　　目前检测鸭成分的方法有普通PCR法和实时荧光定量PCR法，国家检测鸭成分的唯一标准SN/T 3731.5-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第5部分：鸭成分检测PCR法》是用普通PCR法，实时荧光定量PCR法是不同的试剂盒公司开发出来的用于科研用方法，暂无实时荧光定量PCR法检测鸭成分的国家检测标准。荧光定量PCR在灵敏度、准确度、便捷性上均高于普通PCR，但对于需要出具第三方检测报告的单位和企业，只能用国家标准进行检测，本文对SN/T 3731.5-2013检测鸭血样品中鸭成分因鸭血DNA部分降解而导致结果偏离进行了方法优化探索，以提高检测结果的准确性。

　　材料与方法

　　材料与试剂鸭血：购自南京某大型超市。

　　DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0、TaKaRa Taq(5U/uL)、10×PCR Buffer(Mg2+plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、PCR体系预混液Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)宝生物工程(大连)有限公司。

　　仪器和设备：EPS 300电泳仪Tanon；Universal GenoSens1800凝胶成像仪：上海勤翔；ABI 2720普通PCR仪：美国赛默飞；PikoREAL 96实时荧光定量PCR仪(96孔板)：美国赛默飞。

　　引物：参照标准[3]合成扩增鸭源性成分的引物，引物序列见标准[3]表1。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

　　DNA提取方法：鸭血DNA提取方法按照DNA提取试剂盒的方法步骤进行提取。

　　普通PCR检测：鸭血中鸭成分检测步骤见SN/T 3731.5-2013[3]。

　　实时荧光定量PCR检测：将鸭血所提DNA进行鸭源性成分的实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系为：预混液20μL，包括DNA模板1.6uL，Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10uL，上下游引物各0.4uL，Probe 0.8uL，加ddH2O补足20uL。

　　鸭成分实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性30s；PCR反应：95℃5s，60℃30s，进行40个循环。根据扩增曲线Ct值≤35视为检出鸭成分。

　　增加模板进行扩增检测：将鸭血DNA添加不同模板量进行扩增，即PCR反应体系中DNA模板分别添加1uL、2uL、5uL、10uL，反应体系和反应条件见SN/T 3731.5-2013[3]。扩增产物进行电泳检测。

　　二次扩增：将1.7扩增后的产物取2uL加入98uL ddH2O进行100倍稀释，取1ul作为模板进行二次扩增，反应体系和反应条件见SN/T 3731.5-2013[3]。扩增产物进行电泳检测。

　　结果与分析

　　鸭血样品普通PCR和实时荧光定量PCR检测结果：对提取的鸭血DNA利用鸭源性引物进行PCR扩增，反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果见图1。对提取的鸭血DNA利用鸭源性引物进行实时荧光定量PCR，结果见图2。

　　由图1可知，空白对照和阴性对照无条带产生，阳性对照在226bp有条带产生，鸭血DNA扩增后在226bp位置无可见条带，未检出鸭成分。由图2可知，实时荧光定量PCR检测结果空白对照和阴性对照均为未检出，阳性对照Ct值分别为18.26，检出鸭成分，鸭血两个平行样Ct值分别为23.21/23.95，检出鸭成分。普通PCR与实时荧光定量PCR检测结果不一致，可以推测鸭血中鸭DNA可能受物理、化学等因素的影响，核酸有降解。

　　由图3可以看出，添加鸭血模板量1uL、2uL、5uL、10uL，每个模板梯度各2个平行样，扩增后都是Smear，阳性对照条带正常而且很亮，排除了反应体系及引物的原因。因为鸭血与鸭肉不同，血液的保存期短，储存不了太长时间，基因组降解可能性大。

　　二次扩增检测结果：由图4可以看出，对鸭血DNA添加不同模板量1uL、2uL、5uL、10uL扩增后的产物，经过1.8步骤进行二次扩增后，空白对照和阴性对照无条带产生，阳性对照在226bp有条带产生，不同模板添加量1uL、2uL、5uL、10uL二次扩增的扩增产物，2uL模板添加量在226bp位置有弱条带，5uL和10uL模板添加量在226bp位置有明亮条带，无非特异性条带，扩增结果良好。

　　通过增加模板DNA量至5uL后扩增，可以增加目的DNA的含量，通过稀释后，可以降低杂质的含量从而增加目的DNA的含量，提高扩增目的DNA的准确度。目前普通PCR法是国家现有的检测鸭成分的唯一标准方法，是需要出具正式检测报告的检验检测机构的唯一检测方法，而普通PCR法有很大的局限，检测结果不够准确，如果单以SN/T 3731.5-2013方法检测鸭源性成分，可能得到错误的检测结果，因此通过此优化方法来优化检测过程，可以提高检测结果的准确度，可为质检部门及第三方检测机构推广应用，作为实验室检测血液类食品的常规检测手段。

　　参考文献

　　[1]全国文献工作标准化技术委员会.SN/T 1119-2002进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法-PCR方法[S].北京：中国标准出版社，2002.

　　[2]邵碧英，杨婕，张体银.动物产品的DNA提取方法[J].畜牧与兽医，2005，37(9)：47-49.

　　[3]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 3731.5-2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法-第5部分：鸭成分检测-PCR法[S].北京：中国标准出版社，2013.

　　徐慧马慧娟

　　作者简介：

　　徐慧，硕士研究生，高级工程师，实验室技术负责人，江苏省理化测试中心。

　　马慧娟，江苏省理化测试中心。