摘　要：Veriflow^?检测系统是一种基于分子生物学的测定方法，可准确检测乳制品、肉制品、整鸡淋洗液和即食食品中的沙门氏菌。该检测方法将PCR检测与快速、可视化的垂直流层析法相结合，不需要纯化样品、凝胶电泳或基于荧光素扩增目标菌，后期没有复杂的数据分析过程。针对8个不同的食品和环境基质的检测结果表明：对于含量极低的沙门氏菌（人工接种或自然存在），Veriflow沙门氏菌检测（SS）都表现出很高的检测灵敏度。通过对检测结果阳性率的统计分析发现，Veriflow检测结果与FDA微生物分析手册BAM的方法和美国农业部食品安全与检验局微生物实验室方法USDA/FSIS MLG的结果没有显著差异。包容性、排他性、性能稳定性等研究结果均表明Veriflow SS是一款稳定、可靠的产品，能高灵敏性、高选择性、高包容性地检测环境表面、乳制品、肉、整鸡淋洗液和各类即食食品中的沙门氏菌。
    关键词：沙门氏菌属　Veriflow　包容性　排他性　灵敏度
引言
    致病菌带给企业和消费者的危害不言而喻，各国政府和企业都对食源性致病菌的快速诊断寄予厚望，这也使各种检测方法层出不穷。美国Veriflow DNA签名捕获技术的致病菌、腐败菌检测系统，以其快速、准确、可视化等特点在各种检测方法中独树一帜，是一项具有创新性的分子检测技术，即使在未经净化处理的样品基质中也能高灵敏、高精确的检测目标菌。 1 材料和方法
1.1 材料
    a.标准菌株：性能稳定性和批间稳定性测试中阳性样本和阴性样本的培养物，分别采用鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）和枸橼酸杆菌（ATCC 8090）；包容性和排他性测试菌株分别采用104株不同血清型沙门氏菌菌株和35株非沙门氏菌。
    b.样品基质：生牛肉(20%的脂肪)、牛奶(2%的脂肪)、整鸡淋洗液、热狗。
1.2 Veriflow沙门氏菌（SS）检测原理和检测流程
    Veriflow SS是一种基于PCR和DNA签名捕获技术的检测方法，将PCR与DNA签名探针和垂直层析流系统相结合，能够提供特异的、高灵敏度的靶标分子签名检测和快速、易解的检测结果。
    本研究中，对各种基质进行采样、增菌和PCR扩增，获得沙门氏菌属的特异性扩增产物。然后将PCR扩增产物直接滴加到层析卡盒的样本视窗里，再加入4滴缓冲液，仅需3分钟即可产生反应信号。拉动检测卡盒上的开关，观察检测结果。出现一条红色质控线，表示层析卡盒工作正常。质控线和检测线都出现表示沙门氏菌属阳性，而只出现质控线，则表示为阴性结果（如图1所示）。 1.3 稳定性验证研究
    性能稳定性（鲁棒性）验证研究：目的是评估Veriflow SS PCR操作步骤中的微小改变（样本煮沸时间、缓冲液滴加量或层析卡盒反应时间）是否能影响其检测性能（如表1）。     批次间稳定性验证研究：选择2013年9~10月间的3个批次Veriflow SS检测系统，批号依次为ML 0025、ML 0028和ML 0029，在放置0、6和12个月的时间点进行实验（如表2所示）。每个批次对应的时间点，各用10个阳性样本和5个阴性样本。     包容性和排他性研究：用Veriflow SS检测104株沙门氏菌属菌株和35株排他性菌株。
1.4 Veriflow SS与FDA推荐沙门氏菌检测方法对比
    食品基质检测方法比较：不同的食品基质接种不同血清型的沙门氏菌，食品基质的每个样品中均加入稀释24h的肉汤培养物，充分混合，在4℃下平衡48~72h。通过3种检测浓度下的阳性样品个数，来计算MPN。
    整鸡胴体检测方法比较：实验开始前两批各20个样本一直保存在4±2℃。每份样本用400mL IS BPW进行淋洗，从每份鸡肉淋洗液中各取36mL和30mL，分别用于Veriflow SS和FDA推荐方法检测。
表3 Veriflow SS 和FDA参考方法食品基质（生肉，即食食品，乳制品和鸡胴体）检测POD结果

基质	菌株	MPN/ 检测		Veriflow SS			参考方法
			nb	xc	PODCd	95% Cle	x	PODRf	95% Cl	PODC
生牛肉	S.Typhimurium ATCC 14028	_	5	0	0.00	0.00,0.43	0	0.00	0.00,0.43	0.00
		0.11	20	15	0.75	0.53,0.89	15	0.75	0.53,0.89	0.00
		0.34	5	5	1.00	0.57,1.00	5	1.00	0.57,1.00	0.00
热狗	S. Infantis ATCC 51741	_	5	0	0.00	0.00,0.43	0	0.00	0.00,0.43	0.00
		0.58	20	9	0.45	0.26,0.66	9	0.45	0.26,0.66	0.00
		4.38	5	5	1.00	0.57,1.00	5	1.00	0.57,1.00	0.00
牛奶	S. Choleraesuis ATCC 10708	_	5	0	0.00	0.00,0.43	0	0.00	0.00,0.43	0.00
		0.45	20	6	0.30	0.15,0.52	7	0.35	0.18,0.57	-0.05
		2.46	5	5	1.00	0.57,1.00	4	0.80	0.57,1.00	0.20
整鸡淋洗液	Naturally occurring	Lot 1	20	4	0.20	0.08,0.42	5	0.25	0.11,0.47	-0.05
		Lot 2	20	7	0.35	0.18,0.57	10	0.50	0.30,0.70	-0.15

 
a.MPN=最大可能数，使用AOAC MPN计算方法统计参考方法检测样品的POD（阳性率）值；b.n=试验数量；c.x=阳性样本的数量；d.POD_C：阳性结果除以总试验次数得到的阳性率；e.Cl=置信区间；如果dPOD的CI不包含零，则该差异在5％的水平上具有统计学意义；f._=未接种样品
2 结果与分析
2.1 性能稳定性和批次稳定性研究
    性能稳定性实验结果证明：操作步骤的变动不会影响Veriflow SS的测试性能。实验结果符合AOAC-RI PTM要求的分数计算，且所有的阳性样本都经FDA和USDA参考方法确认。这些结果表明，某些测试参数的变化不会直接影响Veriflow SS的测定性能。
    批次间稳定性实验清晰地表明：3个批次的Veriflow SS不同使用时间点的测定性能都保持一致。同时，这些结果也说明Veriflow SS在12个月的使用期限间，均能保持稳定的测定性能。
2.2 包容性和排他性研究
    该实验结果表明：Veriflow SS能准确的检测104株不同的沙门氏菌属。与包容性结果一致，排他性研究结果也证明Veriflow SS能准确区分沙门氏菌属和其他细菌。
2.3 食品基质检测方法结果比较
    食品基质检测结果：3个不同接种水平的样品，低浓度的检测样中，Veriflow SS检测方法和FDA 参考方法阳性检出率无显著差异，所有的只接种干扰菌的样本，通过两种方法的检测结果均为阴性，故两种方法统计学上不存在显著性差异。
    整鸡胴体检测结果：基于POD统计分析，两种方法不存在显著性差异（阳性样品均采用参考方法确认）。
3 讨论和结论
    上述检测结果说明：与FDA和USDA参考方法相比，对于乳、肉、整鸡和即食食品等8种基质中104种沙门氏菌的检测，Veriflow SS与FDA和USDA参考方法的检测结果无显著差异，具有很好的特异性、准确性和可靠性。在整个试验过程中，没有出现假阳性和假阴性结果。与参考方法相比，Veriflow不需要复杂样品制备，仅需18~24h就可以得到准确的检测结果，大大短于参考方法3~4天的检测时间。因此，本研究的结果表明：Veriflow沙门氏菌检测系统是一种灵敏、可靠和简单易操作的快速致病菌检测方法。
参考文献：
[1] U.S. Food and Drug Administration (2001) Bacteriological Analytical Manual, Ch. 5, “Salmonella,” https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm.