番木瓜水溶性多糖的提取、分离与结构分析

2017-07-25 11:18:52 来源：食品安全导刊

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　　分别采用常规水提醇沉和复合酶法，从番木瓜中提取水溶性粗多糖。苯酚-硫酸法测定多糖含量分别为36.48%和53.82%。粗多糖经脱蛋白，大孔吸附树脂脱色，透析及DEAE-纤维素52型阴离子交换层析，得到番木瓜精多糖CPP1和CPP2。Sepharose 6B琼脂糖凝胶柱层析和醋酸纤维素薄膜电泳初步表明CPP1和CPP2为纯度较高的均一组分。红外光谱分析发现典型多糖吸收峰。离子色谱分别测得CPP1、CPP2的主要单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖。实验结果表明，两者均为结构复杂的杂多糖，是首次从该植物中分离得到。

　　材料与仪器

　　主要材料与试剂

　　番木瓜（Carica papaya L.）：广州天河区石牌菜市场销售的夏威夷“Sunrise”品种番木瓜。

　　Sepharose 6B和各标准单糖：美国Pharmacia公司；AB-8型大孔吸附树脂：天津南开大学化工厂；牛血清蛋白：上海伯奥生物科技有限公司；DEAE-52（进口分装），考马斯亮蓝G-250，大茴香醛，果胶酶（酶活力单位≥50万u/g）：国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶：广东光华化学厂有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

　　主要仪器与设备

　　ICS-2500型色谱仪：美国Dionex公司；Equinox 55型傅立叶变换红外光谱仪：德国Bruker公司；D-1冷冻干燥机：北京博医实验仪器有限公司；BS2-100自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司；Spectrum Lab 53型紫外分光光度计：上海棱光技术有限公司；JY 600电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司。

　　实验方法

　　粗多糖的提取

　　复合酶法：在热水浸提前，调整温度至50℃，pH值至4.0，将1 g/L纤维素酶溶液和滤渣液以5:100的体积比混匀，保温2h。再以相同比例加入1g/L果胶酶溶液，调整pH值至3.5，50℃保温2h后，按常规法操作提取多糖。

　　多糖的纯化

　　脱蛋白质：将木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶配制成1g/L的酶溶液，粗多糖用少量蒸馏水溶解，将酶液及多糖液以体积比5:100混匀，55℃保温2h。再按多糖水溶液体积1/3～1/4加入Seveg试剂（氯仿：正丁醇=4:1），混合振荡20min，重复操作10次以上，直至除尽蛋白质。

　　脱色素：预先用蒸馏水把AB-8型大孔吸附树脂浸泡过夜。抽滤后，分别用质量分数为5%的HCl、5%的NaOH浸泡6h，使其充分溶胀。经蒸馏水冲洗至中性后，再用质量分数为95%的乙醇继续浸泡6h，最后用蒸馏水洗至无乙醇味。称取450g经预处理的树脂装入层析柱（45mm×600mm），蒸馏水平衡24h。取120mL经脱蛋白的多糖溶液进行上柱，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液置100mL锥形瓶中。经TLC点板跟踪检测多糖洗脱进程。

　　脱盐：将脱色后的多糖溶液，置于半透膜透析袋（截留分子量14000Da）中，扎紧袋口后在大烧杯中室温下用蒸馏水透析80h。透析过程中，用磁力搅拌器保证透析袋处于流动状态，中间换水9次，以除去盐类及低聚糖等小分子杂质。将袋内的多糖溶液真空浓缩，95%乙醇沉淀，真空干燥即得番木瓜纯化多糖CPP。

　　多糖的分级：称取100g DEAE-52纤维素，用蒸馏水浸泡过夜后抽滤，分别用0.5mol/L NaOH、0.5mol/L HCl、0.5mol/L NaOH浸泡1 h，再用蒸馏水依次处理至中性。抽气装入层析柱（25mm×600mm），蒸馏水平衡24h。称取0.7g番木瓜纯化多糖CPP，溶于适量蒸馏水中，上柱，分别用0.0，0.2，0.4，0.6mol/L NaCl溶液洗脱。控制流速为1mL/min，自动部分收集器收集，10mL/管，各管取样，以苯酚-硫酸法隔管跟踪检测，作洗脱曲线，合并同一洗脱峰的各管样品。洗脱液经过真空浓缩、透析、冷冻干燥、得白色番木瓜多糖洗脱组分CPP1和CPP2。

　　多糖纯度的鉴定

　　凝胶色谱法：将Sepharose 6B经蒸馏水溶胀处理后装柱（20mm×300mm），用蒸馏水平衡24h。将番木瓜多糖洗脱组分CPP1和CPP2分别溶于0.1mol/L NaCl溶液中，上柱，检查番木瓜多糖的纯度。以0.1mol/L NaCl溶液洗脱，流速为1mL/min，自动部分收集器收集，每管收集5mL，用苯酚-硫酸法隔管跟踪检测多糖，作洗脱曲线。

　　结果与分析

　　粗多糖的提取在相同条件下，常规水提醇沉法和复合酶法分别进行3次平行实验。复合酶法的番木瓜粗多糖平均得率为15.87%，苯酚-硫酸法测定其多糖含量为53.82%。而常规水提醇沉法提取粗多糖，得率仅为13.17%，多糖含量在36.48%左右。采用常规热水提取法时，多糖很难从细胞壁中释放出来，得率低。酶法提取与常规热水浸提法相比，不仅使提取的条件更为温和、更有针对性，效率更高，且番木瓜粗多糖的得率及含量均有显著提高，初步证明是一种理想的提取方法。

　　粗多糖的纯化粗多糖经脱蛋白、脱色、脱盐后，外观形态为大小均一的纯白色细粉末颗粒。这表明AB-8大孔吸附树脂对多糖色素吸附效果显著。

　　多糖的分级纯化多糖经DEAE-52纤维素柱层析，在用0.0～0.6mol/L NaCl溶液梯度洗脱下，共出现两个显著单一对称峰，DEAE-52纤维素柱分离效果较好。对两个主导洗脱组分进行收集，并作进一步的纯度鉴定和结构分析。两个组分分别记为CPP1和CPP2，其中CPP1属于中性多糖，CPP2为酸性多糖。

　　多糖纯度的鉴定

　　Sepharose 6B琼脂糖凝胶柱层析：将DEAE-52纤维素分离获得的多糖CPP1和CPP2，加入至Sepharose 6B琼脂糖凝胶柱进行洗脱，CPP1的洗脱曲线上一共出现了三个洗脱峰。两个相对狭窄的小峰出现在第13至22号试管中。但两个杂峰只占了很小的比例，表明多糖CPP1的纯度较高，其分子达到了一定的均一程度。多糖CPP2的洗脱峰单一对称，显示样品为均一多糖，即番木瓜多糖已被纯化。

　　多糖的结构分析

　　红外全波长扫描：多糖CPP1和CPP2经红外光谱检测，从红外光谱图可知，CPP1和CPP2都具有典型的多糖吸收峰，并且两者结构相似，其特征吸收峰及所对应的功能基团见表1。

　　图1 CPP1和CPP2红外吸光光谱

　　离子色谱法测定：经过与标准样色谱图对照，多糖水解液CPP1与CPP2都含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖等五种单糖。并且五种单糖在CPP1样品中的摩尔比例很接近，为15.13：16.87：26.17：17.92：10.26。但在样品CPP2中，葡萄糖是最主要成分，其含量达到88.25%。这一结果也与IR分析一致。因为在CPP2的IR图谱中，在856 cm-1处的伸缩振动峰表明CPP2中含有α-D-吡喃葡萄糖。

　　另外除了单糖，一定含量的双糖海藻糖也存在于CPP1与CPP2的两个样品中。这表明多糖的水解还没有完全。海藻糖是由两分子葡萄糖组成的二糖，因此番木瓜两种多糖的实际葡萄糖含量会更高。

　　复合酶法与常规水提醇沉法相比，具有高提取率、高选择性的特点。酶法的提取率和粗多糖含量分别为15.87%和53.82%。而常规方法的提取率和粗多糖含量仅为13.17%和36.48%。

　　番木瓜粗多糖经脱蛋白、脱色、脱盐和DEAE-52纤维素柱层析后，获得番木瓜多糖CPP1和CPP2两个组分。经Sepharose 6B和醋酸纤维膜电泳试验，初步证明番木瓜多糖CPP1和CPP2均为纯度较高的单一组分。离子色谱测得CPP1和CPP2都是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成。实验结果表明，两者均为结构复杂的杂多糖，是首次从该植物中分离得到。

　　唐若宓广东省轻工业高级技工学校