qPCR即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。昆山吉和力仪器有限公司整理了一些关于qPCR的常见问题，并对这些问题一一进行了解答。
    昆山吉和力仪器有限公司（以下简称“吉和力”）是一家提供专业服务和仪器设备的集成供应商，公司以用户实际需求为导向，提供最合适、性价比最高的仪器，致力于打造一站式服务平台。为了让业内人士对qPCR进行更加深入的了解，吉和力整理了一些相关常见问题，并对这些问题一一进行了解答。
    qPCR的英文全称是Real-time Quantitative PCR Detecting System，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。
    简单来说，qPCR就是利用荧光信号的变化，实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。而常规的PCR无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测。
    如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性？
    ①确定模板RNA完整性，无DNA污染；
    ②RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂；
    ③为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin；
    ④使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱；
    ⑤若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果；
    ⑥设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。
    避免RNA降解的方法有哪些？
    ①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA；
    ②运用良好无污染技术分离RNA；
    ③将组织从动物体取出后立刻提取RNA，并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。
    RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？
    逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，可将对照RNA与样品混合，同对照RNA反应比较产量以检测RNA抑制剂；若对照RNA与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗，以除去抑制剂。
    如何减少RNA模板中的二级结构？
    ①将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火，提高逆转录反应温度；
    ②温度超过60℃时，不能使用oligo（dT）引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP；
    ③RT-PCR产物的长度超过1kb时，反应温度需保持在65℃。
    RNA中有DNA污染的处理方式
    ①若是基因组DNA的污染，可使用DNaseI处理RNA，同时设置没有逆转录对照组反应检测DNA污染；
    ②若是受到外源DNA的污染，可使用抗气雾剂和UDG酶。
    qPCR探针设计的一般原则有哪些？
    ①扩增片段的长度不应太大，一般小于300bp；
    ②探针不能和任一引物互补，且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短，长度不要超过30bp；
    ②探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度；
    ③探针如用于检测多态位点，多态位点应尽可能靠近探针中部；
    ④探针5’端不能是碱基G，G对荧光基团有猝灭作用。
    无反转录酶情况下，对照RNA仍有扩增结果
    ①体外转录时不可能将所有DNA模板消除，因而对照组会含有痕量的DNA。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影响；
    ②可能是引物二聚体的条带。
    扩增产物滞留在加样孔中
    ①可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物，建议将第一链cDNA浓度稀释至100倍再进行二次扩增；
    ②在二次PCR时，使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。
    无Ct信号出现
    ①反应循环参数不够，一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值；
    ②检测荧光信号的步骤有误。SYBRgreen法（SG法）采用的是72℃延伸时采集荧光信号，taqman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集；
    ③引物或探针降解，可用PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针；
    ④模板不足或降解，则可以重新提取核酸模板。
    Ct值出现过晚（Ct>38）
    ①扩增效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，增加镁离子浓度；
    ②反应成分降解或加样量不足；
    ③PCR产物过长，一般采用80-150bp。
    标准曲线线性关系不佳
    ①加样存在误差，是样品浓度不成梯度；
    ②标准品出现降解，避免反复冻融；
    ③引物或者探针设计不佳；
    ④模板中存在抑制物或模板浓度过高。
    溶解曲线存在多个主峰
    ①引物设计不够优化；
    ②引物浓度不佳，上下游引物浓度比例不一致；
    ③镁离子浓度过高；
    ④模板基因组的污染。
    同一样品中，其中某一个荧光信号特别强
    ①试剂配制时反应液没有完全溶化，导致探针量在一管增多；
    ②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；
    ③PCR仪热槽被荧光物质污染，需要清除热槽中的污染。
    扩增曲线有一向上或向下的尖峰？
    ①反应过程中电压不稳定；
    ②可能在20个循环左右时，仪器有停下或仪器有开盖，使光线突然增强；
    ③如果尖峰向下，可能是由卤素灯老化所致，这时应更换。
    部分样本扩增效率过低？
    ①提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；
    ②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；
    ③试剂失效。
    阴性对照或空白对照翘尾
    ①模板提取环境或操作过程有污染；
    ②配液过程存在污染。
    直线型扩增曲线
    ①探针部分降解：一般稀释的探针可在4℃保存至少3个月，探针的反复冻融或导致降解；或者探针在光线下暴露时间太长了；
    ②反应液中有PCR抑制物。
    没有扩增曲线
    ①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段；
    ②电脑设定了自动休眠。
    基线下滑
    基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致。
    扩增曲线断裂
    基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值<15，而基线范围仍取3~15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct前4个循环，重新分析数据。
    样品浓度跨度过大
    样品浓度过高，导致阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，其解决方法同“扩增曲线断裂”。
    山坡形曲线
    常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。