液相色谱-串联质谱法测定火锅食品中罂粟碱等非法添加剂含量的不确定度评定     1 引言
    罂粟壳是成熟罂粟果去籽后的部分，属于国家管制药品，但因其具有调味的功能，所以被一些不法商贩用于火锅、面汤、酸辣粉、卤制品等食品中。罂粟壳中主要成分有罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因等^[1]，长期食用容易上瘾，过量摄入可能引起心律不齐，甚至导致死亡^[2]。因此，准确检测食品中罂粟碱等非法添加剂含量，对于维护人民身体健康、打击非法添加现象具有重要的意义。测量不确定度表征合理地赋予被测量之值的分散性^[3]，对检测结果的可信性有着重要意义。
    本文以罂粟碱为例对液相色谱-串联质谱法测定火锅食品中非法添加剂含量的不确定度进行了评定，计算了测定结果的合成不确定度和扩展不确定度，为评价检测结果提供了理论依据。
    2 材料与方法
    2.1 仪器与试剂
    Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪；TSQ Quantiva MS三重四级杆质谱仪（Thermo fisher）；配加热电喷雾离子源（H-ESI）；XP204型电子天平（METTLER TOLEDO）；超声波清洗机（德国Elma-P120H）；高速离心机（德国Sigma）；WH-861涡旋混合器（南京诺泰施格科学仪器有限公司）；罂粟碱等非法添加剂混合标准溶液（罂粟碱浓度10μg/mL，安谱公司）；乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，美国天地有限公司）。
    色谱柱：Phenomenex C18(4.6mm×100mm，2.6μm)；流动相A为含0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件：0~2min:90%A；2~3min:90%A~10%A；3~7min:10%A；7~8min:10%A~90%A；8~10min:90%A；流速0.5mL/min，进样量10μL，柱温35℃。
    质谱条件：H-ESI；正离子模式；选择反应监测（SRM）扫描模式；喷雾电压3.5kV；毛细管温度350℃，离子源温度350℃，鞘气（N₂）流速4.58L/min，辅助气（N₂）流速7.97L/min。
    2.2 实验方法^[4]
    称取样品5g于50mL聚乙烯离心管中，加入5mL水，振摇使分散均匀，加入15mL乙腈，涡旋振荡1min，加入6g无水硫酸镁/1.5g无水醋酸钠的混合粉末（Waters公司），迅速振摇，涡旋振荡1min，以4000转/分钟离心5min。取上清液1.5mL于DisQuE的净化管（150mg无水硫酸镁/50mgPSA/50mg C18，Waters公司），涡旋混合1min，以10000转/分钟离心2min，移取上清液，0.22μm滤膜过滤，取滤液待测。
    2.3 数学模型
    根据样品测试方法建立的不确定度评估模型如下：
 
    式中：ω—试样中罂粟碱的含量（μg/kg）；C—试样溶液中罂粟碱的浓度（ng/mL）；V—定容体积（mL）；M—试样质量（g）。
    3 不确定度的分析与评定
    3.1 测量重复性引入的不确定度U_rel(X)
    采用A类方法评定测量重复性引入的不确定度，评定结果已涵盖了各步骤的重复性及样品前处理中各因素的影响。
在相同的条件下，取一阳性样品采用相同的方法平行测试10次，测试结果如表1所示：

    按A类评定，测量重复性引入的标准不确定度和相对不确定度分别为：     3.2 样品称量引入的不确定度U_rel(M)
    称量不确定度主要来自天平校准引入的不确定度。校准证书表明最大允许误差0.1mg，按均匀分布，则有标准不确定度：     称量5.0000g样品，其相对标准不确定度为：     3.3 样品溶液定容引入的不确定度U_rel(V)
    样品溶液定容体积为15mL，用1~10mL移液器分两次移取乙腈，每次7.5mL。
  （a）体积：校准证书提供允许误差0.015mL，按均匀分布：   （b）温度：温度变化范围±5℃，按均匀分布：     3.4 样品溶液浓度测量引入的不确定度U_rel(C)
    样品溶液浓度测量的不确定度主要来自：标准物质纯度、标准储备液配制、标准溶液配制及仪器等方面。该方法采用的测试仪器为液相色谱-串联质谱仪，灵敏度很高，综合稳定性的不确定度已在测量重复性中体现，因此这里不再评定仪器引入的不确定度。
    3.4.1 标准物质纯度引入的不确定度
    标准物质纯度不低于98%，引入的不确定度按均匀分布计算：     3.4.2 标准储备液配制过程引入的不确定度
    将混合标准溶液（1mL）全部移至10mL容量瓶中，乙腈定容得到含罂粟碱1μg/mL的混合标准储备液。10mL容量瓶校准证书提供的扩展不确定度为0.02mL，按照3.3计算方法，标准储备液配制过程引入的不确定度为：     3.4.3 标准溶液配制过程引入的不确定度
    移取500μL混合标准储备液，用乙腈定容于10mL容量瓶，得到含罂粟碱50ng/mL的混合溶液，再分别移取该溶液100μL、400μL、1mL、2mL、3mL，乙腈定容至10mL，得到含罂粟碱0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL的标准曲线溶液。该过程中移取100μL、400μL、500μL、1mL、2mL、3mL溶液各一次，10mL容量瓶定容6次。
    按照3.3计算方法，标准溶液配制过程引入的不确定度分量列于表2，合成不确定度为：     3.4.4 样品溶液浓度测量引入的相对标准不确定度     3.5 回收率引入的不确定度
    测量回收率结果如表3所示：     按A类评定，回收率引入的标准不确定度和相对标准不确定度分别为：     3.6 合成不确定度和扩展不确定度
    不确定度分量如表4所示：     合成不确定度为：     取置信概率P=95%，则k=2，则扩展不确定度为：     最终测定结果含量表达为：8.78±0.406(μg/kg)。
    4 结论
    本文较全面地考虑了液相色谱-串联质谱法测定火锅食品中罂粟碱等非法添加剂含量的不确定度来源，计算各不确定度分量、合成标准不确定度和扩展不确定度。评定结果表明，测量重复性和样品溶液浓度测量所引入的不确定度相对较大，其中标准溶液配制过程和标准物质纯度对合成不确定度所做的贡献最大，这对今后的检测具有实际指导意义，可选购纯度更高的标准物质及精密度更高的移液器，设计更合理的标准溶液配制方法，不断提高操作人员的熟练程度，从而减小测量不确定度，提高测量结果的质量。
    参考文献：
    [1] 戴维杰，钮伟民.高效液相色谱法检测掺罂粟壳食品中的罂粟碱[J].中国卫生检验杂志，2003,10(5):607-608.
    [2] 皮立，胡凤祖，师治贤.高效液相色谱-荧光检测法测定罂粟籽和火锅汤料中的罂粟碱[J].色谱，2005,23(6): 639-641.
    [3] 王承忠.测量不确定度原理及在理化检验中的应用[J].理化检验-物理分册，2003,39(7):382-386.
    [4] 杨雯筌，殷耀，张睿，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定火锅底料中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因等五种非法添加物[J].环境化学，2016,35(6):1321-1324.