材料和方法

　　培养基 MRS(液体)、MRS(固体)、糖醇发酵培养基、蛋白胨水、明胶液化培养基、硝酸盐还原培养基

　　试验方法 乳酸菌的分离、鉴定:无菌操作条件下，称取5g泡菜，碾碎，加入装有玻璃珠的三角瓶中，再加入50mL灭菌生理盐水，充分震荡后用生理盐水做10倍的梯度稀释，取10-4和10-5稀释度做平板涂布，置于37℃生化培养箱培养24h。选取表面光滑凸起，周边整齐，直径1.0～1.5mm的菌落，做革兰氏染色，再对革兰氏阳性杆状无芽孢菌落，多次划线培养直至得到纯菌株。最后依据《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行生理生化实验。

　　分子生物学鉴定:采用试剂盒提取上述菌株的DNA作为模板，进行16s rDNA 基因PCR克隆。PCR扩增引物为27F(5’-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，反应体系为25μL(10×buffer 2.5μL, 25 mmol/L MgCl2 1μL, 25 mmol/L dNTP 1μL, 27F和1492R(各20μmol/L)各0.5μL, DNA模板1μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，灭菌去离子水18.2μL)，反应程序为95℃ 5min;95℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 90s，35个循环。PCR产物经琼脂糖电泳验证后，测序由北京鼎国生物技术有限公司完成。

　　结果 乳酸菌的筛选、分离、鉴定:根据菌落的大小、透明程度、颜色、表面是否光滑、凸起等特征用MRS培养基从泡菜中筛选出15株阳性菌株，然后转接于MRS固体培养基中，通过复筛，选出1株菌落呈圆形、直径1.0-1.5mm，凸起、微白色、湿润、边缘整齐(图1)，革兰氏阳性无芽孢杆菌(图2)，初步命名为W菌株。

　　图1 W菌株菌落形态 图2 W菌株的菌体形态

　　根据表1中生理生化试验结果及《常见细菌系统鉴定手册》初步鉴定该菌株属于乳酸菌。

　　表1 生理生化试验结果

　　检测项目 结果 检测项目 结果

　　蔗糖 + 木糖 +

　　乳糖 + 山梨酸钾 +

　　麦芽糖 + 过氧化氢酶 —

　　甘露醇 + 明胶液化 —

　　海藻糖 + 吲哚试验 —

　　葡萄糖 + 硝酸盐还原酶试验 —

　　山梨醇 + V—P试验 —

　　注：+：试验结果为阳性;-：实验结果为阴性

　　分子生物学鉴定结果:对菌株进行16S rDNA基因克隆、测序，通过NCBI中使用BLAST软件比对，将相似度高的序列用Mega软件编辑，通过UPGMA计算法构建比对进化树，综合生理生化试验结果，确定该菌株为植物乳杆菌(lactobacilus plantarum)。

　　图3 W菌株与9株乳酸菌的16S rDNA同源性分析进化树

　　本文从泡菜中筛选出一株革兰氏阳性无芽孢杆菌，经过形态学观察、生理生化鉴定及分子生物学鉴定，确定该菌株为植物乳杆菌。

　　吴云 江西省湖口县市场和质量监督管理局