1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　腰果为从某大型超市中购置的普通腰果，并将其在0～4℃环境下贮藏。

　　所用试剂均为国产分析纯。

　　1.2仪器与设备

　　DHG-9143BS-III型电热恒温鼓风干燥箱——上海新苗医疗器械制造有限公司;SX-5-12型箱式电阻炉——天津市泰斯特仪器有限公司;KDN-DI型自动定氮仪——上海新嘉电子有限公司;UV-1801型紫外可见分光光度计——北京瑞利分析仪器有限公司;SC-3610型低速离心机——安徽中科中佳科学仪器有限公司;HSJ系列数显恒温水浴锅——金坛市科析仪器有限公司。

　　1.3方法

　　1.3.1原料营养成分的测定

　　水分含量测定：采用常压干燥法，GB/T5009.3—2010《食品中水分的测定》;灰分含量测定：采用灼烧法，GB/T5009.4—2010《食品中灰分的测定》;蛋白质含量测定：采用凯氏定氮法，GB/T5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》;粗脂肪含量测定：采用索氏提取法，GB/T14772—2008《食品中粗脂肪的测定》;膳食纤维含量测定：采用酶重量法，GB 5009.88-2014;碳水化合物含量测定：采用《预包装食品营养标签通则》(GB 28050-2011)问答(修订版)的方法。

　　1.3.2蛋白质含量的测定

　　蛋白质的具体含量测定：使用考马斯亮蓝Bradford法，将牛血清蛋白作为标准的蛋白，运用考马斯亮蓝G-250染色，其得到的标准曲线方程为：Y=0.0046X-0.0125，R2=0.9964。运用以下公式对腰果蛋白提取率进行计算。

　　1.3.3原料处理及蛋白提取

　　1.3.3.1原料预处理

　　将腰果仁在粉碎机中粉碎处理，放置在干燥器中干燥，使用石油醚脱脂[2]，最终得到腰果粉。

　　1.3.3.2

　　腰果蛋白质的具体提取方法涉及到以下三种：

　　①Tris-HCl法[1]：取用脱脂后的腰果粉1g，在其中加入50mL 0.2mol/L pH 8的Tris-HCl缓冲液，在45℃的温度条件下搅拌浸提6h，在4000r/min条件下离心15min，最终取上清液测定蛋白质含量。

　　②盐溶法：取用脱脂处理后的腰果1g，向其中加入50mL 0.14mol/L的NaCl溶液，放置在45℃的温度条件下搅拌浸提6h，在4000r/min转速下条件下离心15min，最终取上清液测定蛋白质含量。

　　③碱溶酸沉法：选用脱脂后的腰果粉样1g，向其中加入50mL的蒸馏水，用0.01mol/L的NaOH溶液调pH值至10，将其放置在45℃条件下搅拌浸提6h，在4000r/min条件下离心15min，最终取上清液测定蛋白质含量。

　　1.3.4蛋白质提取工艺的确定

　　1.3.4.1单因素试验设计

　　最终确定使用碱提法，在相关条件达到一定时，其料液比则使用1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)这6个水平层次，0.01mol/L的NaOH溶液调节提取液pH值7、8、9、10、11、12共6个水平，提取温度采用25、30、35、40、45、50℃共计6个水平，提取时间采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h共5个水平，来分别进行相应的单因素试验。

　　1.3.4.2正交试验设计

　　根据单因素试验结果，选择料液比、提取液pH值、提取温度、提取时间进行四因素三水平L9(43)正交试验，试验设计见表1。

　　表1 正交试验因素与水平

　　水平 因素

　　料液比(g/mL) pH 提取温度/℃ 提取时间/h

　　1 1:30 7 30 1.0

　　2 1:40 8 35 1.5

　　3 1:50 9 40 2.0

　　2结果与分析

　　2.1腰果原料基本成分分析

　　从表2上，能够明显看出的是，粗脂肪含量是腰果仁成分含量占比最高的，达到44.13%，碳水化合物则为27.22%，蛋白质为19.41%。

　　表2 腰果原料基本成分分析

　　成分 粗脂肪 蛋白质 膳食纤维 碳水化合物 水分 灰分

　　含量/% 44.13 19.41 3.72 27.22 3.07 2.45

　　2.2提取方法的选择

　　从以往的实验来看，在腰果蛋白提取方法选择上，不同的提取方法，提取率也有所差异：碱溶法相比于盐溶法和Tris-HCl法，所呈现出的蛋白质提取率更为显著，提取率为40.09%(P<0.05)，盐溶法提取率最低，为20.15%。因此，本文实验采取了碱提法。大量研究证明，碱能够让腰果的结构变得更为疏松，从而有效的打破了大分子间的部分氢键，并提高了蛋白溶解度，促使其提取率得到提高。

　　2.3单因素试验

　　2.3.1料液比对腰果蛋白质提取率的影响

　　从实验来看，当选取温度为45℃、时间1h、pH9的情况下，将料液比作为变量进行3次平行试验后，料液比从1:10～1:40(g/mL)的过程中，其蛋白质提取率有了明显的上升趋势。而料液比在1:40(g/mL)的情况下，其提取率得到显著提升，最大达到56.32%(P<0.05)。

　　伴随着提取液使用量的不断提升，提取率开始不断下降，降低为33.05%。导致这一结果的原因，可能在于溶液体积不断增大、溶剂增加，原料中的内外蛋白质浓度差也开始提高，蛋白质也就越容易渗入到提取液中，提取率也得到了相应增大。而当提取液使用量不断增长时，蛋白质溶液开始出现饱和，加水量过多，酸沉过程中上清液所残留的清蛋白量明显提升，蛋白质的损失量开始出现提高，反而使得提取率下降。故此，选择料液比应当为1:40(g/mL)。

　　2.3.2 pH值对腰果蛋白质提取率的影响

　　当选取的料液比为1∶40(mg/mL)、温度45℃、时间1h时，将pH值作为变量来进行3次平行试验。从结果来看，提取液pH值从7上升到10的情况下，腰果蛋白质提取率会伴随着pH值的提升而不断提升，最高能够达到53.25%(P<0.10)，而随着pH值的不断提升，其提取率便开始出现下降。这主要是由于碱本身能够让腰果结构变得更为疏松，打破了蛋白质分子之间的部分氢键，以此使得蛋白质与淀粉发生分离，从而提升了蛋白质提取率，而伴随着pH值持续增大，蛋白质在强碱环境下更容易出现水解、变性，过程中蛋白质的颜色也会变深，如若蛋白质长时间受到强碱影响，则会发生“胱赖”反应，并生成有毒化合物。故此，实验的pH值最佳范围在9-10左右。

　　2.3.3提取温度对腰果蛋白质提取率的影响

　　当选取料液比为1:40(mg/mL)、pH9、时间1h时，将温度作为变量进行3次平行实验。结果发现，不同提取温度，对于蛋白质提取率影响显著。当提取温度在25～35℃范围时，提取率开始不断上升，从56.00%上升至61.07%，而伴随着温度变量的持续提高，提取率开始降低到54.73%。其原因在于35℃前，温度上升的同时，亲水基团逐渐展开，巯基含量得到提升，蛋白质溶解度持续升高;而随着温度的不断上升，疏水基团被展开、暴露，导致蛋白质分子出现聚集，溶解度明显下降，从而影响到提取率的下滑。而当温度上升到一定范围，蛋白质还可以发生变性。故此，实验提取温度范围应当在35℃左右。

　　2.3.4提取时间对腰果蛋白质提取率的影响

　　当选取1:40(mg/mL)、温度45℃、pH9的情况下，将浸提时间作为变量来进行3次平行试验。从结果来看，在1.5h前，腰果蛋白提取率会伴随着时间的不断延长而持续提升，从48.27%上升到63.93%(P<0.05)，而在1.5h之后，提取率便开始出现了下降趋势，下降到55.47%。这主要是由于去脂腰果粉本就需要耗费一定溶胀时间，在充足的溶胀时间下，才有利于蛋白质的分离溶解，但如果提取时间过长，浸提液中的已溶蛋白质出现了饱和现象，开始随着疏水基团的暴露，蛋白质出现凝聚沉淀现象，从而促使提取率开始降低。

　　2.4腰果蛋白质提取条件优化

　　在单因素试验基础上做正交试验，优化提取工艺。正交试验结果见表3。

　　表3 腰果蛋白提取条件优化的正交试验结果

　　试验号 A B C D 蛋白质提取率/%

　　1 1 1 1 1 58.50

　　2 1 2 2 2 70.77

　　3 1 3 3 3 73.27

　　4 2 1 2 3 69.74

　　5 2 2 3 1 71.75

　　6 2 3 1 2 78.51

　　7 3 1 3 2 59.36

　　8 3 2 1 3 65.48

　　9 3 3 2 1 70.63

　　K1 67.51 62.53 67.50 66.76

　　K2 73.13 69.13 70.38 69.55

　　K3 65.16 74.14 67.93 69.50

　　R 7.98 11.60 2.88 2.79

　　表4 正交试验结果方差分析表

　　因素 偏差平方和 自由度 F值 F0.05 F0.01 显著性

　　A 100.77 2 10.23 19 99.00

　　B 203.23 2 20.61 19.00 99.00 *

　　C 14.62 2 1.47 19.00 99.00

　　D 15.26 2 1.55 19.00 99.00

　　误差 9.85 2

　　注：*.差异显著(P<0.05)。

　　选取料液比(A)、提取液pH值(B)、提取温度(C)、提取时间(D)4个因素，以腰果蛋白的提取率为指标，得出优化条件。从表3极差R值可以得出，对腰果蛋白提取率影响因素由大到小依次是B>A>C>D，即pH值对腰果蛋白的提取率影响最大。可以得出，最佳工艺条件为A2B3C2D2，即料液比1:40(g/mL)、提取液pH9、提取温度35℃、提取时间1.5h。由表4方差分析结果表明：pH值为影响腰果蛋白质提取过程的显著因素，料液比、提取时间、提取温度为不显著因素。根据最佳工艺条件对腰果蛋白进行提取，测得腰果蛋白的提取率可达79.0%。

　　使用最佳的提取方法碱提法，利用单因素、正交试验得出腰果蛋白提取的最佳工艺条件是：料液比1:40(g/mL)、提取液pH9、提取温度35℃、提取时间1.5h，在此条件下所得到的腰果蛋白提取率能够达到79.0%。

　　参考文献

　　[1]叶婧,曾育蒙,王秀丽,李建平. 腰果蛋白的提取及功能特性研究[J]. 食品研究与开发,2016,06:43-49.

　　[2]殷贺中. 不同种脱脂榛子粉、榛子蛋白粉理化性质比较研究[D].河南农业大学,2013.

　　胡蓉 江苏省生产力促进中心理化测试中心