摘　要：以脱毒苹果和未脱毒苹果为原料，采用HS-SPME技术萃取苹果中的香气成分，GC-MS技术测定苹果中的香气成分，通过比较脱毒苹果与未脱毒苹果香气成分的含量和种类的差异，找出脱毒苹果的特征香气，得出病毒侵染对苹果香气成分的影响。经研究，脱毒苹果香气成分主要有酯类、醇类、酸类、醛类、酰胺类、烯类和其他类化合物，未脱毒苹果的香气成分主要是酸类、酯类和醇类和烯类和其他类化合物。脱毒苹果特有的香气成分为：丙酸芳樟酯、乙酸异戊酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯、1,2－苯二甲酸二酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、月桂醇、正己醇、十一醇、丁二醇、2－甲基－2－丁醇、6－甲基－3－庚醇、4－甲基甘露醇、雪松醇、3－酞酰亚氨甲基苯甲酸、碳酸等。病毒侵染使得苹果的香气物质种类减少，含量下降。
    关键词：脱毒苹果　未脱毒苹果　香气成分
    1 苹果的经济价值及社会地位
    苹果为蔷薇科落叶乔木，是世界上种植面积最广的一种果树，我国苹果的种植面积和产量都居世界第一。苹果果实含有大量的营养物质，如糖分、膳食纤维、钙、铁、维生素C、维生素B₁、维生素B₂等30多种人体所需物质^[1]。
    2 苹果病毒概述及目前的预防研究
    苹果病毒在我国广泛发生，已成为限制我国苹果优质高产的关键因素^[1]。目前已在我国发现并鉴定的苹果病毒有：苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、苹果凹果类病毒(Apple dimple fruit viroid,ADFVd)^[2]，苹果一旦感染上病毒就很难治愈。由于苹果病毒是通过嫁接传染，无传毒介体，所以栽培无毒苗木是防治的主要途径^[3]，苹果病毒的危害日益受到栽培者的重视^[4]。针对这种情况，近年来，宋来庆、李元军、赵玲玲等人^[5]采用热处理的方法培育出脱毒“烟富3号”苹果苗木，成为近年来最畅销的苹果苗木之一。但大众无法区分脱毒苹果与非脱毒苹果，容易造成两种苹果的混淆。目前，科学工作者通过对其多项指标进行检测来区分，但操作复杂，涉及的步骤较多，实验数据庞大，处理数据消耗时间较长，不仅浪费资金，而且缓慢的检测速度不能满足广大市场对苹果的需求。
    3 苹果香气成分探究的目的及意义
    果实香气是反映果实风味品质的重要指标之一，研究苹果香气物质对提高苹果品质、进行优选育种及其深加工具有重要意义。果实香气源于某些挥发性物质，目前，苹果香气中已鉴定出350多种成分，但只有含量超过其味感阈值的物质成分才会对果实风味的形成起重要作用，同一个果实的不同部位，致香物质的含量也有差异^[6]。本次探究主要针对病毒对苹果果实及其叶子挥发性成分的影响，通过比较脱毒苹果与非脱毒苹果香气成分种类和含量的差别，找出脱毒苹果具有的特征香气成分，将其转化为一项或简单的几项指标，通过该特征香气来判断样品苹果是“脱毒苹果”还是非脱毒苹果，为苹果的病毒检测提供一种新手段。
    4 研究方法
    4.1 顶空固相微萃取（HS-SPME）
    顶空固相微萃取是一种无溶剂萃取技术，它集采样、萃取、浓缩、进样于一体，具有简单、快速、高效、无污染、便携、灵敏度高^[7]、易于与其他仪器联用等优点，已被广泛应用于挥发性成分分析^[8]。该方法优化了分析条件，建立了快速测定香气物质的方法，在常见香气物质的质量浓度范围内有良好的线性关系，对常见香气物质的定量比较准确^[9]。可快速检测出苹果所含的几百种香气成分，具有高效、便捷、快速、准确的特点。
    4.2 气相色谱质谱联用(GC-MS)
    色谱法一般是由固定相和流动相组成。气相色谱法的流动相是气体，因此要求样品应在色谱柱内转化成气体。根据分配系数的差异，使样品在固定相与气相之间分离。通过峰的形状、大小对物质进行定性分析，通过保留时间、峰面积、内标物的峰面积及浓度来对物质进行定量分析。质谱法是利用电磁学、质核比(m/z)对物质进行分离分析的一种方式。采用SPME与GC-MS结合，对挥发性物质进行鉴定分析，并优化了SPME条件，为进一步研究挥发性物质的种类和含量提供理论和数据支持^[10]。此方法可以快速处理大量实验数据，找出脱毒苹果和非脱毒苹果的香气成分区别。
    5 实验仪器及试剂
    5.1 实验仪器
    GC-MS-2010q气质联用仪：日本岛津公司；SPME纤维萃取头CAR/DVB/PDMS（50μm/30μm）：美国Supelco公司；SPME手动进样手柄：美国Supelco公司；DB-Wax色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）：美国Agilent公司；DF-101Z集热式恒温加热磁力搅拌器：河南省予华仪器有限公司；分析天平：福州华志科学仪器有限公司；微量进样器（10μL）：上海市安亭微量进样器厂；移液管：5mL、10mL。
    5.2 实验样品和试剂
    乔纳金苹果叶、嘎啦苹果叶：烟台市栖霞苹果园采摘；脱毒苹果叶：烟台农科院提供；NaCl（分析纯）：上海国药集团；3-辛醇（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司。
    6 实验方法
    6.1 样品预处理
    将已采集的嘎啦、乔纳金及脱毒苹果的苹果叶进行剪碎，并放入研钵中研碎。利用分析天平称量，每组等分后做2份样品（约0.5g/份），将已分好的样品放入保鲜膜中密封保存，并贴好标签备用，依次为1~6号。
    6.2 萃取条件的设定
    在之前实验的研究基础上对萃取的条件进行设定^[11]。
    萃取时间5min，萃取温度50℃，预平衡时间5min，解析时间5min。
    6.3 GC-MS条件的设定
    在之前实验的研究基础上对气相色谱-质谱联用仪的参数进行设定^[12]。
    GC条件：色谱柱为DB-Wax（30m×0.25mm× 0.25μm）；进样口温度：230℃；检测器温度230℃；载气：He；流速：3mL/min；分流比为50.0。
    升温程序：初始温度（起始柱温）40℃，保持2min，后以6℃/min的速度升温至100℃，再以5℃/min的速度升温至200℃，最后再以10℃/min的速度升到230℃，保持5min。
    MS条件：EI电离源；电子能量70eV；离子源温度200℃；接口温度230℃；扫描范围m/z 30~500。
    6.4 实验步骤
    ①将已预处理好的样品1号乔纳金苹果叶加入到15mL棕色萃取瓶（内含转子）中，利用5mL移液管取4mL氯化钠饱和溶液加入，再利用10μL的微量进样器取3-辛醇加入（3-辛醇浓度为101mg/L）。
    ②将15mL棕色萃取瓶放入恒温加热磁力搅拌器中，设定萃取温度50℃，预平衡时间5min并采用秒表计时，然后先将涂有PDMS涂层的纤维萃取头调到2cm刻度处，插入到萃取瓶后再将黑柄推下进行萃取，注意针头不要接触液面，采用秒表计时5min。
    ③萃取完毕后，先将黑柄往上提再将纤维萃取头拔出，并调至2.6cm刻度处，待气质联用仪的电脑显示绿色Ready，则进针于GC-MS中，再按start键开始测定，解析时间5min后将针提出，运行时间40min。
    ④样品2~6号重复上述步骤进行测定。
    ⑤将各个样品的总离子流色谱图和挥发性成分种类图的数据进行完善并保存。
    6.5 挥发性成分的定量计算方法
    采用内标物（本实验为3-辛醇）计算出各个挥发性物质的相对含量，计算公式为：
    7 结果与讨论
    脱毒叶子与不脱毒叶子最大的挥发性成分差异为：醛类物质所占的比重远远超过普通叶子为20%以上，而普通叶子醛类的比重均在10%以下，这可能与通过一定手段对苹果树脱毒有关；脱毒叶子酯类、醇类和醛类所占比重均在20%左右，为挥发性成分的主要种类；酸类物质所占的比重较普通叶子略高；肼类物质略有下降，低于普通叶子；脱毒叶子出现苯类物质，占2%左右。对于乔纳金、嘎啦及脱毒苹果叶这3种品种中所检测出来的挥发性成分的主要物质来看，有约10种物质在脱毒叶子中未检测到。     8 结论
    对于乔纳金、嘎啦及脱毒苹果叶这3种样品，经HS-SPME萃取后再经GC-MS方法分析确定了其主要挥发性成分，并采用峰面积归一化法比较脱毒与不脱毒叶子之间的差异，对于监控苹果的健康状况、提高或改善苹果的品相品质具有重要意义。
    从各种类的香气成分所占比重来分析，脱毒叶子中醛类物质所占的比重远远超过普通叶子为20%以上，而普通叶子醛类的比重均在10%以下；脱毒叶子挥发性成分主要种类为酯类、醇类和醛类，所占比重均在20%左右；酸类物质所占的比重较普通叶子略高；肼类物质略有下降，低于普通叶子；脱毒叶子出现苯类物质，占2%左右。
    从具体的挥发性物质来分析，乔纳金与嘎啦苹果叶中所共有的十种成分在脱毒苹果叶中未检出，为6-甲基3-庚醇、3-辛烯-1-醇、氨基草酰肼、1,1-二甲基乙基肼、5-甲基-2-（1-甲基乙基）反式环己酮、五氟酸庚酯、乙醇醛二聚体、2-辛醇、5-甲基-2-（1-甲基乙基）-环己醇。
    通过结合以上两种手段，可以建立一种检测果树是否感染病毒的方法和理论体系，对于检测果树的健康成长以及指导农业生产具有积极的作用。
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