高效液相色谱串联质谱法检测豆芽中的6-苄基腺嘌呤含量

2016-08-23 17:27:52 来源：食品安全导刊

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6-苄基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)是一种人工合成的细胞分裂素，与植物内源性激素具有相似的结构及性质，为一种植物生长调节剂[1]。如果人体摄入过量会刺激皮肤黏膜，出现食道和胃黏膜损伤、恶心、呕吐等症状。目前，测定豆芽中6-BA的方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-大气压化学源质谱法及液相色谱—串联质谱法[2-4]等。本研究采用LC-MS/MS法来测定豆芽中的6-BA，提取试剂为酸化甲醇，以乙腈及水(含0.1%甲酸)为流动相进行梯度洗脱，经过反相色谱分离后以多反应监测方式进行检测。
　　材料和方法
　　仪器 API 4000型三重四极杆串联质谱仪，LC-20A液相色谱仪(包括二元输液泵及自动进样器)。药品及试剂 6-BA标准品(含量97.0%),甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
　　标准储备溶液精密称取6-BA 0.1000g于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，作为标准储备溶液。此标准储备溶液每毫升相当于1.0mg 6-BA。
　　色谱柱：Symmetry C18柱，3.5m，150×2.1mm I.D.，waters公司;流动相：乙腈-水(含0.1%甲酸);流速：0.25 mL/min;柱温：25℃;进样量：10μL。梯度洗脱条件见表1。

　　质谱条件采用电喷雾离子化源;离子喷射电压：5500V;温度：500℃;源内气体1(GS1，N2)压力：55psi;气体2(GS2，N2)压力：55psi;气帘气体(N2)压力：15psi;正离子方式检测;6-BA的解簇电压(DP)为70V，碰撞能量(CE)为80eV;用于定量分析的离子反应为m/z 226.2→m/z 64.9，6-BA结构及[M+H]+的产物离子扫描质谱图见图1。

　　图1 6-BA的结构及[M+H]+的产物离子扫描质谱图

　　豆芽样品的预处理称取豆芽样品500g用食物粉碎机粉碎后，取5g样品(精确至0.01g)于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL酸化甲醇(每100mL甲醇中加入乙酸100μL，混匀)，用均质机匀质3min，超声提取3min，1,2000rpm离心10min，上清液转入25mL容量瓶中，样品再用10mL酸化甲醇重复提取一次。合并上清液，用水定容至刻度，摇匀，取部分液体经0.45μm滤膜过滤，供LC-MS/MS分析。
　　空白豆芽萃取液制备选择在生产过程中未添加6-BA的豆芽。按1.6试样处理方法提取，经0.45μm有机滤膜过滤。可进行LC-MS/MS分析，以确定在6-BA出峰处不存在干扰。
　　结果与讨论
　　色谱行为和专属性　按“豆芽样品的预处理”操作, 分别制备空白豆芽样品、空白豆芽加入6-BA标准溶液(相当于含15μg/kg6-BA的豆芽样品)进行测试。典型色谱图分别见图2-A和图2-B。结果表明：空白豆芽中的内源性物质不干扰6-BA的测定。

　　图2 测定豆芽中6-BA的典型MRM色谱图

　　线性范围和灵敏度取空白豆芽萃取液，依次加入适量6-BA标准系列溶液，配制成相当于豆芽浓度为2.5、5、15、45和100μg/kg的豆芽样品萃取液，按“豆芽样品的预处理”项下操作，记录色谱图;以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积为纵坐标，进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线(y=1.35e+004x+2.58e+003，r =0.9983)。结果表明6-BA在2.5～100μg/kg范围内线性良好，方法检出限为1μg/kg(信噪比S/N=3)。
　　回收率和精密度试验分别制备了相当于含6-BA 5、15和100μg/kg的低、中、高3个浓度豆芽样品，按1.6项的操作方法进行处理，每浓度六样本分析，并与标准曲线同时进行，以当时的标准曲线计算样品的测得浓度，求得本法的精密度与回收率。低、中、高3个浓度的回收率范围分别为90%～98%、92%～101%和91%～102%，精密度分别为4.5%、5.6%和8.9%，结果均符合相关要求。
　　质谱条件优化将浓度为100ng/mL的6-BA标准溶液吸入注射器中，放置于蠕动泵进样器上，以20µL/min的速度进样，对质谱条件进行优化，尽量使待测物响应信号最高化。在实验过程中比较了6-BA在正、负两种离子化方式的响应值，发现正离子化效率高于负离子化效率，正离子响应较为稳定，因此选择了正离子扫描方式。
　　经过Q1全扫描，选择了响应信号最高的m/z 226.2作为6-BA分析的母离子，在MS2扫描方式下，找到一些碎片离子，其中m/z 91.0响应最高，m/z 64.9次之，在多反应监测扫描方式下，m/z 226.2→m/z 91.0离子对响应信号较高，但干扰较大，故选择m/z 226.2→m/z 64.9用于6-BA的定量分析。在MRM模式下，在蠕动泵持续进样的情况下，对各项质谱参数进行优化，使得待测物响应值达到最高。
　　色谱条件优化虽然质谱专属性高，但将样品中的内源性物质与待测物进行分离还是必要的，以减少对测定的干扰，所以对色谱条件进行了选择及优化。
　　6-BA在小粒径的C18色谱柱上都有较好的保留，所以选择了实验室常用的Symmetry C18柱(3.5μm，150×2.1mm I.D.)。应用反相色谱条件时，LC-MS/MS分析方法应用的有机相主要为乙腈和甲醇，选用乙腈时，6-BA的色谱行为较好。试验中发现甲酸的加入会抑制6-BA的信号，但考虑到能够使待测物与内源性物质充分分离，并且能够改善峰形，所以选择了0.1%的甲酸作为水相。
　　提取条件的选择试验中考察了以下几种提取试剂，包括甲醇、酸化甲醇和乙酸乙酯，结果发现酸化甲醇的提取效率要高于另外两种试剂，而超声提取的使用同样会提高待测物的提取效率，所以最终选择了用酸化甲醇作为提取试剂，进行超声提取。
　　本研究采用高效液相色谱-串联质谱法来检测豆芽中的6-苄基腺嘌呤含量，方法采用多反应监测进行定量，排除了内源性物质干扰，提高了专属性。该法灵敏度高、准确可靠，检出限达到1μg/kg，前处理方法简单，有较强的实际应用价值。
　　沈阳食品检验所
　　穆姣姣崔相勇周长民王冬妍