黄曲霉毒素是一种二氢呋喃香豆素的衍生物。它的致癌性和对DNA的破坏性是经过验证而被全球医学界普遍认同的。黄曲霉毒素的毒性非常大，其毒性比氰化钾还要大十倍，动物中得急性肝炎、出血性坏死和胆管增生等疾病均是由此类毒素所致，对动物的健康有着较坏的影响。黄曲霉和寄生曲霉的代谢产生了黄曲霉毒素。另外，人们日常使用的谷物中，由于没有及时的晾晒导致谷物发霉也会产生黄曲霉和寄生曲霉，从而也会产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素对人类食物的污染是黄曲霉毒素对人体产生危害的主要祸源。黄曲霉毒素在我们日常食物中普遍超标存在，尽管一些国家为此制定了一系列严格的相关规定，但是由于其存在广泛且有些食物中含量较低，因此对含有此类毒素的食物并不能得到完全的防控，需要特别指出的是发展中国家因为黄曲霉毒素而污染的食物与人口中患癌数量成正相关性关系。不仅如此，黄曲霉毒素也同时会诱发人体其他疾病的病变，且存在叠加效应，因此，黄曲霉毒素对人体产生的危害具有严重性和深远性。目前，黄曲霉毒素已经分离出十二种分毒素，其中，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。前者为基本毒性结构后者与致癌有关。B1在动物体内经过羟化作用产生了代谢物M1。其中M1和M2 主要存在于牛乳中。B1为毒性及致癌性最强的物质。黄曲霉毒素的化学分子量为312-346，其外表形态呈无色结晶体形态，具有抗高温等物理性质，但是该毒素对紫外线免疫力较低;该毒素能够较容易溶于有机物中，例如油类和甲醇丙酮等，但是不溶于水等无机物中。此外该毒素也不溶于乙醚和石油醚等物质。在中性溶液中表现较稳定，但在强酸性溶液中会分解迅速。

　　黄曲霉毒素M1的检测方法较多，各种方法得到效果大致相同，但是从成本、复杂度等方面综合考虑后，国际上目前采用较多的方法有：免疫化学法、色谱法、电化学及化学发光法等方法。其中在色谱法中，高效液相色谱法可以较为快速准确的检测食物中黄曲霉毒素M1的含量，因此，该方法在众多检验机构和食品企业中使用率较高。它的特点是能够大大降低实验过程中对操作者产生的危害。试验部分试验中所采用的检测设备及仪器分述如下：提取溶剂采用乙腈/水，检测仪器为免疫亲和柱净化，光化学衍生荧光检测器，该检测器的优点是能够同时测定乳制品中黄曲霉毒素M1和M2的含量。试剂与样品,试验中使用的黄曲霉毒素M1标准品：采用Sigma公司的毒素制品(46319-U)：10μg/mL)，黄曲霉毒素M1的免疫亲和柱采用国内生物科技公司产品。Merck公司生产的乙腈和甲醇试剂;国药集团生产的：磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钾和氯化钠作为分析纯;Millipore产的超纯水仪提供试验用水;PBS的缓冲液按1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸氢二钾、8g氯化钠、0.2g氯化钾比例进行调制，用水将其定容到1升，并将PH值调制到7.4。乳制品来自全国各地随机抽取得到并处于温度为4的环境中保存。

　　试验采用的超高效液相色谱仪配荧光检测器，贝克曼64AR型离心机，步琪R-205型旋转蒸发仪器，Organomation N-EVAP112型氮吹仪和Gilson Aspec GX-274型自动固相萃取装置等均采自美国生物设备制造公司。配制标准储备液和流动相,配制黄曲霉毒素M1标准储备液,将适量的黄曲霉毒素M1标准样品提取并存放至5ml棕色试验瓶中后用乙睛将其定容到10ppb中间储备液，吸取少量配备好的10ppb的黄曲霉毒素M1放置在提前准备好的容量瓶中;配备1%的乙酸水溶液并定容，并得到含量为1ppb的黄曲霉毒素M1的储备液，将其保存在避光低温环境下，同时保持密封。标准曲线的配制

　　将M1黄曲霉毒素用上述配制好的乙酸水溶液进行稀释后得到含量为1ppb的储备液，将其配入到五个5ml牛奶液体样品中，得到含量为20、50、100、200、500ppt的基质加标标准曲线。配制流动相,水相为64%的去离子水;按乙睛18%/甲醇18%标准配制有机相，用0.22μm滤膜对配制好的流动相进行过滤，每日对流动相进行更新。水相应在经过10分钟的超声脱气后使用。主要检测仪器条件,在UPLC-FLR系统中，保证温度控制在30度，流速为30μl/min，流动相为64:18:18水/甲醇/乙睛;进样量为20μl，运行时间定为5分钟，弱洗针液和强洗针液分别为3：1：1水/甲醇/乙睛和5：1：1乙睛/异丙醇/水，365nm的激发波长，429nm的发射波长。分离提取M1族黄曲霉毒素,在50ml的离心管中放入10g乳液样品并加入25ml的乙腈，将其配置好后旋转3min，并进行超声提取10min和8000r/min离心5min得到上清液，提取上清液并将其进行旋蒸，当旋蒸到液体剩余10mL后，将其放入50ml容量瓶，加以PBS定容。M1黄曲霉毒素免疫亲和柱需要25ml溶液过滤清洗，并用10mi的PBS对柱子进行淋洗。去除全部的流出液体，随后用5ml甲醇洗脱免疫亲和柱对剩余的洗脱液进行收集并放置在指定容器中;对容器用氮气吹干，再用乙腈/水溶液把容器中残留物质进行溶解，最后将过滤后的液体再次用0.22μm滤膜进行过滤，并装入收集瓶中保存为随后使用。

　　试验结果及讨论

　　UPLC-FLR系统中的色谱柱的参数和试验效果同其他柱子有着明显的差别，其主要体现在该色谱柱填料粒的直径较小、柱子的体积较小、出峰时间快。因此在具体的使用过程中，溶剂中的有机相和水相的配比要求较为严格，以此保证有机相和水相配制比例与初始的流动相保持相似。只有这样得到的色谱峰值图示才有试验意义。M1黄曲霉毒素的保留产生的影响源于色谱柱的影响因素。峰值较强的位置出现在甲醇/乙睛2:3阶段。该情况经分析后可知：色谱柱中含有少量的连接单克隆抗体的悬浮物质，除此之外，黄曲霉毒素抗体对毒素具有吸附能力，因此，采用配比为甲醇/乙睛2:3作为洗脱液得到的效果会更好，不仅如此，M1黄曲霉毒素还可以被彻底的洗掉，保证数据的准确性。综上所述，试验经过验证后采用甲醇/乙睛2:3另加入50%的去离子水作为溶样溶液。在试验阶段中，M1黄曲霉毒素的吸附作用较强，使用常规方法会严重影响试验效果，因此在实验中需要使用免疫亲和柱。但是其使用成本很高，所以需要对柱子的使用进行优化，以期能够在高效使用的前提下降低成本，从而实现大批量快速且有效的检测。由上述因素可知，黄曲霉毒素具有吸附的特性，且柱体的容量较小。采用每次进样10ml过滤离心后的样品分五次加入免疫亲和柱过滤。这要可以保证过柱的时间得到明显的缩短，且堵塞的几率得到大幅降低。根据免疫亲和柱使用规定，柱子只能使用一次，由于其成本较高，所以对溶液进行优化很有必要。经过检测后发现，用过的柱子用高度甲醇多次清洗后并用PBS溶液对其进行润洗后的回收率并没有出现明显的下降，也没有发现存在其他未知干扰。由此可知该优化方案没有对试验产生影响。波长选择,通过之前的试验检验，M1黄曲霉素的描述参数中激发和发射波长分别定为360nm、420nm的到数据符合预期，数据较为理想，因此对其参数进行采用。线性关系,本次试验通过配制基质加标标准曲线来校正样品处理过程中由于仪器所引起的误差，经过检测后得到其线性关系良好。经过对M1黄曲霉毒素分别在50、100、200ppb下测定回收率和精密度，结果表明黄Ml曲霉毒素回收率为86.48%-95.78%，RSD小于10%，达到精度要求。回收率试验将从市场上采集到的乳液及乳粉样品中的黄曲霉毒素M1进行加标回收率试验，得到的数据如下表1所示：

表：乳制样品分析结果及精密度（n=6）

　　超高效液相色谱检测不仅能够在短时间对样品进行检测，在检测质量上也具有明显的优势，尽管如此，其使用成本对我国来看仍然偏高，本文也在保证试验质量的前提下对试验工作中进行了适量的优化，降低了检测成本，值得推广。

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