近年来不断出现的食品安全问题成为公众日益关注的重大公共卫生问题。高等院校招生规模逐年上升，校园后勤社会化进程对校园食品安全监管提出更高要求。为适应新形势新矛盾，校内原有卫生力量应在遵守与执行国家正规卫生检疫部门的管理制度的前提下，积极开展食品卫生管理改革，形成基层检测力量，加强食品卫生前沿哨点的监测与风险评估研究与实践。本校前身为第一军医大学，拥有食品、营养、微生物等专业复合型卫生人才，具备食品安检及应急能力，建成国家认证的卫生检测实验中心及完善的临床实践服务等综合条件，长期以来学校保持了军队后勤建设标准，建有一整套管理体系，对食品卫生保持高标准严要求，如坚持食堂采购食品公示、环境消毒、碗筷消毒、从业人员健康上岗等制度。可是，学校在加强自身管理之余，对采购食品和加工食品的质量监督则更多依赖于国家卫生管理体系，尚不能完全实现自我检测上报功能。自从我校从2006年招收预防医学食品安全方向学生起，本学科在微生物学教学科研实践过程中一直摸索如何才能调动和提高预防医学生的实践及创新能力，本着学以致用的原则，组建了食品安全预防小组，开展微生物学检测技术及实际应用相关工作，不断探讨适宜的校园或社区内食品检测技术、评价与管理体系，为建立科学、合理的检测和评价方法服务。本文依据国家食品卫生微生物学标准，选择菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群、肠杆菌科细菌快速生化鉴定等重要评价指标，对校园内食品进行实验研究与探讨。

　　样品采集,紫菜饭卷，早上七点随机进高校食品店新鲜购买，该紫菜卷由紫菜包裹着已煮熟的米饭和鸡蛋等材料制作而成，由汉堡包包装纸包装，室温放置3h后正式实验。仪器,冰箱：0～4℃;恒温培养箱：35～37℃;恒温水浴箱：45～47℃;奥林巴斯BX6050显微镜。培养基与试剂,营养琼脂、乳糖微量发酵管(杭州天河微生物试剂有限公司);乳糖胆盐发酵培养基、EC肉汤、EMB(伊红美兰培养基)、V-P试剂、吲哚试剂(广东环凯微生物科技有限公司);肠杆菌科E75/15鉴定试剂盒(北京路桥技术责任有限公司);苯丙氨酸试剂(10% FeCl3水溶液)、革兰氏染色液、0.85%生理盐水(实验室自制)。方法,菌落总数测定 用平板菌落计数法测定(根据国标GB/T 4789.2-2010)。大肠菌群测定 用多管发酵法测定(根据国标GB/T 4789.3-2003)。粪大肠菌群测定,将乳糖胆盐管产酸产气的菌液接种在EC肉汤中，在44.5℃温度下培养，若细菌能生长并发酵乳糖产酸产气，则粪大肠菌群的检测为阳性。随后将EC肉汤产酸产气的菌液划线接种到EMB平板中，挑选EMB平板中可疑菌落(紫黑色带有金属光泽的菌落)进行革兰氏染色，油镜观察。肠杆菌科细菌鉴定 挑取单个菌落用肠杆菌科E75/15鉴定系统鉴定。评价标准 参照《中华人民共和国国家卫生标准》糕点、面包卫生标准-GB7099-2003进行判定。

　　菌落总数测定结果

　　紫菜卷样品经10-1、10-2、10-3倍稀释检样，菌落总数为385 CFU/g(见表1和图1)。参照糕点、面包卫生标准-GB7099-2003国家卫生标准正常值,菌落总数值=385CFU/mL，≤1500CFU/mL,检测食品菌落总数未超标。

　　表1 紫菜卷中菌落总数检验结果

　　稀释度 实验菌落数 平均菌落数 菌落总数CFU/g

　　10-1 30 47 38.5

　　10-2 2 4 3 385

　　10-3 4 3 3.5

　　图1 紫菜卷菌落总数检验结果图(A.10-3 B.10-1 C.10-2)

　　紫菜卷大肠菌群MPN值检验结果

　　待测样品经1：10、1：100、1：1000的稀释倍数稀释后，每个稀释倍数接种3管乳糖胆盐发酵管。经过48h后，结果(表2)显示1：10稀释倍数接种的3管乳糖胆盐管中有一管有产酸产气的现象(图2)。将该管产气的菌液分别接种到EC肉汤和EMB平板进行培养，结果见图3，在EMB平板上挑取两个可疑菌落(黑色菌落)，分别做乳糖发酵试验和革兰染色镜检(图4、5)。EMB平板分离的可疑菌落乳糖发酵实验有产气的现象，革兰染色镜检结果为革兰氏阴性无芽孢杆菌。结果显示大肠菌群阳性,MPN值=400/100g。

　　表2 紫菜卷中大肠菌群MPN值检验结果

　　阳性管数 大肠菌群最可能数

　　(MPN)/100g 95%可信限

　　0.1mL×3

　　(10-1) 0.01mL×3

　　(10-2) 0.001mL×3

　　(10-3) 下限 上限

　　—— ——— ——— 400 <50 2000

　　1 0 0

　                        　图2 紫菜卷中大肠菌群MPN值检验结果   　　(A.0.1mL×3 B.0.01mL×3)

　　                                                 图3 EMB平板分离结果                图4 乳糖发酵实验结果图 

　　                                      图5 EMP平板分离革兰染色镜检             图6 EC肉汤培养管

　　紫菜卷中粪大肠菌群MPN值检验结果

　　在EC肉汤管中生长并产气的大肠菌群阳性的结果(图6)，可同时报告为粪大肠菌群阳性，MPN值就是大肠菌群的MPN值，故粪大肠菌群MPN值=400/100g。

　　紫菜卷中单个菌落编码检索结果

　　经肠杆菌科细菌E75/15生化系统鉴定结果(表3)，鉴定细菌的编码为04222，细菌名称为普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)。

　　表3 细菌编码表

　　3项实验为一组 实验项目 实验结果

　　(+、-) 记录数字 记录码(每组带圈的数字之和)

　　第1组 动力 - 4 2   赖氨酸 - 2   鸟氨酸 - 1

　　第2组 柠檬酸盐 + ④ 4     硫化氢 - 2      尿 素 - 1

　　第3组 吲 哚 - 4 2    V-P + ②    苯丙氨酸 - 1

　　第4组 甘露醇 - 4 2   肌 醇 + ②    山梨醇 - 1

　　第5组 蜜二糖 - 4 2    侧金盏花醇 + ②     棉子糖 - 1

　                                  　图7 实验前的试剂

　                                  　图8 加菌培养后试剂(加圈-反应阳性)

　                                  　图9 吲哚、V-P、苯丙氨酸安瓿瓶加入相应试剂后的反应   (加圈-反应阳性)

　　平板菌落总数实验表明，实验前应预估食品样品中可能微生物含量，通过预实验来确定选择合适的3个稀释度。正式实验时菌落计数范围应控制在30-300个/皿读数内，每个稀释度的菌落形成单位(CFU，Clony Forming Unit)应呈现相应的比例,多次测试样品提示，选择10、100、1000倍稀释度可行。实验误差通常有：稀释液体未充分混匀、移液量不精确、稀释时未按要求更换移液管、稀释加样后未及时倾注控温约46℃琼脂、倾注平皿未混匀、倾注琼脂过热都会出现菌落数混乱不呈比例现象;动作过慢易导致琼脂提前凝固;不同公司琼脂在菌落色素、琼脂凝固温度方面有些许质量差异等。掌握方法后，可以精确进行样品的活菌计数，平板表面和平板内都有菌生长，表面菌落大，菌落生长特征易观察，该方法属于准确和直观的食品卫生质量评价指标。目前，还有更方便的3M细菌总数测试纸片法(3M PetrifilmTM)，测试中发现不能适用于所有食品，有颗粒带颜色的食品易干扰结果判断。大肠菌群、粪大肠菌群实验表明，根据国家卫生标准中大肠菌群的定义，选择实验基本步骤为乳糖发酵阳性管→弱选择性培养基伊红美兰(EMB)平板分离划线→筛选紫黑色菌，转种乳糖微量发酵管复发酵、接种EC肉汤44.5℃培养→EC肉汤培养物再经EMB分离→挑黑色菌经肠杆菌科生化鉴定，实验经初发酵、复发酵、证实实验定性是否为大肠菌群、粪大肠菌群阳性(44.5℃阳性判定为粪大肠菌群阳性)，查MPN定量大肠菌群、粪大肠菌群值。实验表明，乳糖胆盐管变黄色及导管产气、乳糖微量管黄色产气、EMB出现紫黑色菌，EC肉汤混浊，样品几项实验均为阳性结果，同时用大肠菌株(CMCC 44113)做平行对照，结果一致，说明方法可行。肠杆菌科细菌E75/15生化系统鉴定实验采用国产微生物试剂公司成熟产品，疾控和食品检验单位均有应用，多次测试表明，实验结果稳定，准确率高，对照菌株埃希氏大肠菌结果明显，判定准确。紫菜卷样品中筛选到的紫黑色、革兰氏染色阴性的杆菌，经氧化酶测试后，全套生化试剂鉴定细菌编码为04222，初步判断为普城沙雷氏菌，该菌为条件致病菌，兼性厌氧，一般存在于土壤，实验中未检测到致病性的大肠杆菌，但条件致病菌的存在仍然提示食品可能受到粪便和土壤污染，应加强检测及管理。

　　从实验观察，校园食品中，加工程序较多、配料较复杂、存放较长时间的食品易发生食品安全问题，此类食品有：奶茶、豆浆、绿豆沙等饮品、面包、奶油蛋糕等糕点;香肠、烤鸡等肉制品微生物指标超标都很容易发生食物中毒。本次实验，我们选取了紫菜卷作为实验标本，设计了几项重要指标进行方法学研究，旨在提高食品卫生实验室检测和报告能力。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。而大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染，大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。而粪大肠菌则是总大肠菌群的一个亚种，直接来自粪便，若检出粪大肠菌群即表明受检物已被粪便污染，它能更贴切地反应食品受人和动物粪便污染的程度。

　　食品安全微生物学检测常常选用3M和大肠菌群纸片来快速测试，该方法适合于筛检，结果还不够直观精确。本实验建立了一套平板菌落计数法测定菌落总数，多管发酵法测定大肠菌群和粪大肠菌群和肠杆菌科E75/15鉴定系统,相结合的方法，直接分离和观察细菌形态、菌落特征、生化反应现象，能鉴定到大肠菌群的菌种，提高了致病菌的检验能力，实验结果则更直观可信，该实验技术本身不需要特殊仪器设备，可行性高，覆盖范围广，鉴定结果准确可靠，符合国家卫生标准检验要求。

　　谭楚婷 李婷婷 谢雄雄 罗军* 

　　南方医科大学公共卫生与热带医学学院

　　*罗军，女，副高，硕士，研究方向：食品卫生检验。基金项目：突发食品安全事件的微生物学检验、评估及应急处理实践教学体系的研究，南方医科大学2014年特色教育教学改革立项建设项目(2013-84-22)