我国冷却肉的消费现状发展趋势

　　目前，发达国家生肉供应中的80%是冷却分割肉，而在我国基本上是低附加值的冷冻肉，分割肉不足 20% 。但是，随着经济的快速发展，人们越来越多的吃冷却肉，而吃冻肉的人群越来越少，由此可以看出我国冷却牛肉市场仍有很大的发展空间。诸多因素表明，我国消费市场将迎来冷却牛肉产量的增加和牛肉消费热潮的到来。目前，我国肉牛屠宰加工业已逐渐由小型、个体性屠宰发展为规模化、养殖机械化、屠宰精细化、分割冷链流通连锁销售的现代肉品生产经营模式，部分大型企业引进了国外先进的畜禽屠宰分割生产线，在引进和消化国外先进技术的基础上屠宰工艺技术水平得到迅速提升。

　　我国冷却肉产业存在的问题

　　随着冷却肉替代冻肉，伴随着冷却肉产生的问题也越来越多。我国从事畜禽屠宰的加工人员绝大多数没有经过正规的专业技能培训，从事肉品检验检疫的人员大多数没有经过正规的专业培训，在屠宰车间具有正规卫生检验专业人员资格的更是凤毛麟角。冷却牛肉作为牛肉的主要消费形态，代表生鲜牛肉生产和消费的发展方向，但是在肉牛屠宰及冷却牛肉生产、运输、贮藏和销售过程中，微生物污染状况是整个屠宰过程中微生物污染的主要来源，会影响到胴体表面的微生物数量，进而影响到终产品的品质。同时，我国加工冷却牛肉的企业在工厂中加工的各个工序环节没有严格的卫生标准，加工环境堪忧，极大的制约了我国冷却牛肉产业的国际竞争力。这是由于屠宰及加工各个环节的微生物污染差异，可能导致E. coli O157:H7的流行，影响到最终产品的微生物初始量和菌群多样性，从而进一步显著影响到真空包装冷却牛肉的安全性，并且国内针对微生物污染研究较少，几乎没有研究加工过程中E. coli O157:H7对肉制品的影响。因此，只有从屠宰、加工的工序上研究微生物对于肉品的污染，并予以针对性的控制，才能从最健康的角度、从根本上解决我国真空包装冷却牛肉食用安全的问题，保障肉牛产业的健康发展。

　　肉牛屠宰的屠宰要点

　　活牛验收→宰前管理→击晕、放血→上挂→去头、蹄、皮→开胸→去内脏→胴体劈半→宰后检验→修整→冲洗→冷却、成熟→分割→包装、贴标签→金属探测→最终产品冷(冻)藏→销售.工艺要点:去皮 预剥皮，包扎肛门。在四肢裸关节的位置，将皮张行圆周切开，用挑刀的方式，后肢沿跟腱线向肛门的方向挑开，前肢沿侧腋窝线的方向剑突上30cm至40cm的位置挑开。在肛门与盆骨腔外口的连接处，沿盆骨腔的外边缘行圆周切开，用力拉出肛门，将直肠与盆骨腔的剩余连接部分全部切开，使肛门整体脱离屠体以能拉出20cm至25cm为准，将肛门结扎环套在肛门结扎钳上，是气动开关使之扩到最大位置，套入用塑料袋包好的肛门，结扎在离肛门头15cm到20cm的位置。去内脏 在后腹会阴位置开一个能用手放进腹腔内的孔，用正握反刀的方式伸进腹腔内，刀刃正对腹白线的位置，向下用刀将腹腔全部切开至胸膛锯开处。冲洗 冲洗在胴体冷却前实施，即采用高压常温水、热水或有机酸冲洗、喷淋或蒸汽喷淋等技术，采用这些措施清楚可视物(如牛毛、粪便等)，有效减少胴体表面的微生物污染。相对与国外企业普遍应用多种胴体冲洗喷淋减菌技术，国内的肉牛屠宰企业常用的仅有清水冲洗方法，且多数为人工喷洗。只有极个别的企业配备有高压清水清洗、热水巴士杀菌喷淋、有机酸喷淋等设备。冷却 胴体冷却是指采用一定的冷却程序(温度、湿度或外加冷却物质)降低宰后胴体温度，排除胴体内部热量的过程。其目的在于保证肉品安全、最大限度地延长产品的保质期，降低导致最终产品品质劣化的胴体变化，尽可能快的降低胴体的温度，抑制微生物的生长并减缓肌肉蛋白质的变性。分割 胴体分割主要指将牛半胴体根据市场需要分割成不同的部位。将半胴体推出排酸库并对其进行四分体处理，每切割一块半胴体，切割锯消毒一次，及时清理锯掉的肉、油、骨、骨末，放入废弃物盛装桶内，妥善处理。然后进入分割间进行不同部位分割并修正，除去碎骨、结缔组织、淋巴、淤血及其他杂质。大肠杆菌的易感环节 ,在动物皮肤、消化道,呼吸道是一个病原微生物扩散的重要来源。动物的消化道,呼吸道在屠宰过程中会导致病原微生物的扩散。肉牛屠宰线,直接接触被宰杀的动物可以很容易地被由动物病原微生物污染,并逐渐成为致病细菌的媒体和动物尸体屠宰后的传播甚至成为病原体污染的来源。在微生物污染的方方面面，屠宰、切割、加工、存储和分布的肉。在宰前检验过程中,动物皮毛是交叉污染的一个重要媒介。在流通、环境相互联系,这导致病原体通过动物——动物、动物——设备——动物途径传播。在使用未消毒的放血工具,导致了微生物进入血液的短尸体的血液循环扩散到各个部分。最后在将牛肉进行分割时，工作人员可能使用消毒不合格的刀具或操作不当将最终产品污染。

　　AFLP的发展和技术原理及其应用

　　AFLP(amplified fragment length polymor-phism)是1992年由荷兰Key gene公司的Zabeau和Vos在PCR和RFLP的基础上发展起来的新一代分子标记技术,其结合了RFLP和RAPD技术的优点,具有高分辨率、稳定性好、高效率和高灵敏度等优点,且比RFLP和RAPD技术有更大的优越性。后来,AFLP技术发展成为分析任何来源DNA指纹图谱的一项普遍技术,并在研究植物的基础上也开始用来研究微生物和动物,为构建遗传图谱、遗传多样性、品种鉴定等相关领域的研究提供了一个非常有效的工具。在食品加工过程中,分子分类学可以用来鉴定和跟踪致病菌和腐败菌的扩散。AFLP是新一代的指纹图谱技术,其具有高重复性和高分辨率。Ifigenia等人从家禽的6个不同的加工过程、不同的设备(传送带、刀具、冷冻柜、手套等)和环境中,用平板分离得到了88个Pseudomonas fluoresceds和Pseudomonas putida菌株,用AFLP技术分析,获得了AFLP指纹图谱,将88个菌株分为6个AFLP群,在群内菌株间具有高水平多样性。 AFLP不仅是一种指纹技术,也是基因组研究的一个非常有效的工具。如STS(序位标)标记一样,AFLP可以作为联系遗传图谱和物理图谱的一个桥梁;⑥AFLP分析一个重要特点是对模板DNA浓度变化不敏感;⑦AFLP另一个重要的特点是,当反应过程中标记引物耗尽时,扩增带型将不受循环数的影响。由于AFLP对模板浓度存在一些差异,也会得到强度不一致的谱带,所以AFLP技术能够检测谱带的强度多态性;⑧AFLP技术不需要制备探针,进行分子杂交,操作简单,易于标准化和自动化;⑨AFLP可以进行定量分析,也可作为共显性标记。

　　AFLP技术的原理及其反应流程

　　AFLP是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术,其基本原理:先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段,再进行选择性扩增,使用双链人工接头(Artificial adapter)与基因组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应的模板DNA,用含有选择性碱基的引物(primer)对模板DNA基因选择性扩增,获得的DNA扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测,根据扩增片段长度的不同检出多态性。为避免放射性同位素造成的危害,科研人员还将荧光标记、溴化乙锭(EB)染色和银染等标记技术用于AFLP结果分析,使得AFLP技术更为安全可靠。

　　食源性致病菌与肉品安全

　　食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题，全球每年发生食源性疾病的病例高达40-60亿例;美国每年约8100万人患食源性疾病，5000人死亡，在食源性疾病上的花费达数十亿美元;在我国食源性致病菌引起的疾病己成为威胁我国食品安全的重大问题之一。动物在从饲养到屠宰、加工、运输、储藏至餐桌的过程中，环节众多，根据危险性评估，大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和单增李斯特菌是三种最严重的牛肉源性致病菌，引起危害的可能性最大[9]。Salmonella spp. 和 E. coli O157:H7 可以由牛无症状携带，与肉和肉制品的污染密切相关[10]。在美国的食源性疾病病例中，由沙门氏菌引起的住院病例占25.6%;E. coli O157:H7 引起的住院病例占 21.7%。大肠杆菌0157：H7介绍,大肠杆菌O157:H7(Escherichia coliO157:H7)是肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)的主要血清型,其致病力强,能引起人类出血性腹泻和溶血性尿毒综合症(HUS)以及血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等。在美国、加拿大、英国和日本等发达国家都发生过E.coliO157:H7的暴发流行。从已有的流行病学调查资料看,我国也存在散发病例,但还没有爆发流行的报道。我国1988年首次分离到E.coliO157:H7。近几年也通过监测,先后从牛、猪、羊、粪便,肉类等食品中查到E.coliO157:H7。在北美,牛肉中检出E.coliO157的比例是0%～3.7%,西班牙为5.1%。EHEC O157:H7 除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌基本相似，但也有某些生化反应不完全一致，具有鉴别意义。

　　材料与方法,根据肉牛屠宰过程，分别采集粪便样品、皮毛檫拭样品、去皮后、去内脏后、喷淋后、冷却后胴体擦拭样品及分割肉等分离出的 6株菌，来源于3个样品。实验方法;样品的采集 对于工序1至工序4、工序6，参照Berum等的描述采用纱布擦拭法进行采样。简言之，用无菌的0.9% NaCl和0.1%蛋白胨水将20cm×20cm的灭菌纱布浸润后，依次擦拭牛二分体的13个采样点。擦拭完成后将纱布放入均质袋中，在每个二分体的擦拭面积约为 2500cm2。为了探明肉牛自身的带菌率，本研究同时对粪便样品进行了采集，按照 Madden等的描述，由工厂的工人使用灭菌刀具将牛直肠切开，在靠近肛门处用无菌手套称取越10g直肠粪便，将直肠粪便放入均质袋。样品抵达实验室后，擦拭、粪便样品每个均质袋加100ml灭菌的TSB，分割肉样品均匀秤取25g样品于事先加好225mlTSB的袋中。所有样品放入均质器中均质1分钟后，按照Barkocy的描述，采用改进的免疫磁分离方法， 放入培养箱中25℃培养2-3h、42摄氏度培养6小时。增菌后的样品分成两部分， 所有的操作步骤都按照说明书的指导，简单的说，将20ul免疫磁珠加1ml的样品中，于室温下反应3分钟，经过3的反复吸附，最后将抗体-抗原结合物重新悬浮于100μLPBS缓冲液中。分别取 50μL上述缓冲液分别涂布于CT-SMAC、科玛嘉平板上，平板左边使用灭菌棉签涂布，右侧使用接种针划线。涂布后的平板放置37℃的恒温培养箱中培养24小时。每个平板上挑取 3个可疑菌株，在麦糠凯琼脂上划线培养，挑取纯化后的菌株接种MUG-LST肉汤，赖氨酸羧酶生化鉴定管，鸟氨酸生化鉴定管，吲哚生化鉴定管，MR-VP生化鉴定管，纤维二糖生化鉴定管，棉籽糖生化鉴定管，西蒙氏枸杞酸盐生化鉴定管进行生理生化鉴定，符合 E coli O157:H7 典型特征的菌株将保存. DNA的提取 (CTAB法提取)称取材料50mg，液氮研磨三至四次,将粉末放到装有800µl 2×CTAB提取缓冲液的2ml离心管中,加入60µl巯基乙醇混匀，60度预热30min,其间混匀二至三次取出样品于室温放置,待样品冷却到室温加入800µl氯仿：异戊醇(24：1),振荡混匀，12000rpm离心15min,取上清到一新2ml离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，振荡混匀，12000rpm离心15min,取上清到一新2ml离心管中加入1.5倍体积1×CTAB沉淀液，放置20-30min，12000rpm离心15min,将沉淀晾干溶于200µl TE-buffer(溶解).预扩增;离心数秒,按下列参数进行PCR扩增，现将模板DNA进行预变性，参数设置为94℃进行2min;先进行变性，参数设置为94℃进行30s后，进行复性，参数设置为56℃进行30s，然后进行延伸，参数设置为72℃进行80s，如此循环30次;最后进行最后的延伸，参数设置为72℃进行5min，用4℃进行保存。选择性扩增预扩产物1:20稀释后作为选扩模板按下列参数设置PCR循环:第一轮扩增参数：先进行变性，参数设置为94℃进行30s后，进行复性，参数设置为65℃进行30s，然后进行延伸，参数设置为72℃进行80s。 以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮。接着先进行变性，参数设置为94℃进行30s后，进行复性，参数设置为55℃进行30s，然后进行延伸，参数设置为72℃进行80s，如此循环23次;最后进行最后的延伸，参数设置为72℃进行5min，用4℃进行保存。

　　分析与结论

　　分子生物学方法是基于Enzyme-generated DNA片段的识别模式和DNA序列的特征正变得越来越多的用于广泛的细菌的流行病学。在使用PCR或限制性内切酶技术之间, AFLP有许多优点而且更容易执行,比PEGE的做法更简单和使用更少的昂贵的设备。AFLP比随机扩增多态性DNA(RAPD)分析再次使用更方便的,它在研究标记核苷酸等要求例如需要标记核糖分型或插入序列类型时不需要Southern-blotting。

　　许多研究证明AFLP在微生物方面的价值。AFLP在专业性和重复使用方面已被证明。它使整个细菌基因组研究发现到由于基因突变或缺失造成在限制性位点变化成为可能。探索基因组多态性，有大量可供选择的酶，它们几乎有无限的可能,。AFLP对寻找基因组多态性类型是非常有用的，是其主要应用方面。但是它在对容易确定的分子多态性的基础方面也很有用。在这方面,它于突变序列类型应用相似,但它的优势在于可以研究更多例的基因组。