表面微生物检测方法

2015-08-14 15:36:33 来源：中国食品科技网

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　　空气、食品接触面微生物检验方法、检验标准

　　1、目的：

　　检测生产车间空气、操作人员手部、与食品有直接接触面的机械设备的微生物指标，生产区域环境当中病原微生物的监控，达到规定标准，以控制食品成品的质量。

　　2、参照标准：

　　中华人民共和国国家标准《一次性使用卫生用品卫生标准》GB15979-1995、《HACCP原理与实施》、中华人民共和国国家标准《公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定》GB/T 18204.1-2000、中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、出入境检验检疫局二000四年《出入食品微生物检验培训教材》中《出入食品生产厂卫生细菌检验方法》、日本东京冷冻食品检验方法。

　　3、采样与检测方法：

　　3.1空气的采样与测试方法

　　3.1.1样品采集：

　　(1)取样频率：

　　a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行采样，以便了解车间卫生清扫消毒情况。

　　b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行采样。

　　c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间进行采样，如有检验不合格点，整改后再进行采样检验。

　　d)实验性新产品，按客户规定频率采样检验。

　　e)正常生产状态的采样，每周一次。

　　(2)采样方法

　　在动态下进行，室内面积不超过30 m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙1 m;室内面积超过30 m2，设东、西、南、北、中五点，周围4点距墙1 m。采样时，将含平板计数琼脂培养基的平板(直径9 cm)置采样点(约桌面高度)，并避开空调、门窗等空气流通处，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min。采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6h，若样品保存于0～4℃条件时，送检时间不得超过24h。

　　3.1.2菌落培养：

　　(1)在采样前将准备好的平板计数琼脂培养基平板置37℃±1℃培养24 h，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。

　　(2)将已采集样品的培养基在6 h内送实验室，细菌总数于37℃±1℃培养48h观察结果，计数平板上细菌菌落数。

　　(3)菌落计算：

　　a)记录平均菌落数，用“个/皿”来报告结果。用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，不可遗漏。

　　b)若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。

　　3.2工作台(机械器具)表面与工人手表面采样与测试方法：

　　3.2.1样品采集：

　　(1)取样频率：

　　a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行擦拭检验，以便了解车间卫生清扫消毒情况。

　　b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行全面擦拭检验。

　　c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间可疑处进行擦拭，如有检验不合格点，整改后再进行擦拭检验。

　　d)实验新产品，按客户规定擦拭频率擦拭检验。

　　e)对工作表面消毒产生怀疑时，进行擦拭检验。

　　f)正常生产状态的擦拭，每周一次。

　　(2) 采样方法：

　　a)工作台(机械器具)：用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面(取与食品直接接触或有一定影响的表面)取25cm2的面积，在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。

　　b)工人手：被检人五指并拢，用浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。

　　(3)采样注意事项：

　　擦拭时棉签要随时转动，保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具体位置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间

　　3.2.2细菌·大肠菌群的检测培养:

　　样液稀释：将放有棉棒的试管充分振摇。此液为1：10稀释液。如污染严重，可十倍递增稀释，吸取1ml 1：10样液加9ml无菌生理盐水中，混匀，此液为1：100稀释液。

　　3.2.2.1细菌总数：

　　(1)以无菌操作，选择1～2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿(平行样)，将已融化冷至45℃左右的平板计数琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。

　　(2)待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36℃±1℃培养48 h后计数。

　　(3)结果报告：报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数

　　3.2.2.2大肠菌群：

　　(1)平板法:

　　a)以无菌操作，选择1～2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿(平行样)，将已融化冷至45℃左右的去氧胆酸盐琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。待琼脂凝固后,再覆盖一层培养基，约3-5 ml。

　　b)待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36℃±1℃培养24h后计数。

　　c)结果计算：以平板上出现紫红色菌落的个数乘以稀释倍数得出。

　　d)结果报告：报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数

　　(2)试管法:

　　a)以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到BGLB肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。

　　b)置BGLB肉汤管于36℃±1℃培养48±2h。记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

　　c)结果报告：按BGLB肉汤管产气管数，查MPN表报告每25cm2食品接触面中或每只手的大肠菌群值。

　　3.2.3金黄色葡萄球菌检测

　　(1)定性检测

　　a) 取1ml稀释液注入灭菌的平皿内，倾注15-20ml的B-P培养基，(或是吸取0.1稀释液，用L棒涂布于表面干燥的B-P琼脂平板)，放进36±1℃的恒温箱内培养48±2小时。

　　b)从每个平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌的菌落作血浆凝固酶实验。

　　c) 结果报告：B-P琼脂平板的可疑菌落作血浆凝固酶实验为阳性，即报告手(工器具)上有金黄色葡萄球菌存在。

　　(2)定量检测

　　a) 以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到含10﹪氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。

　　b) 置肉汤管于36±1℃的恒温箱内培养48小时。划线接种于表面干燥的B-P琼脂平板，置36℃±1℃培养45～48小时。

　　c) 从B-P琼脂平板上，挑取典型或可疑金黄色葡萄球菌菌落接种肉汤培养基，36℃±1℃培养20～24小时。

　　d) 取肉汤培养物做血浆凝固酶试验，记录试验结果。

　　e) 报告结果：根据凝固酶试验结果，查MPN表报告每25 cm2食品接触面中或每只手的金黄色葡萄球菌值。

　　3.3工厂环境中病原体的检测计划与方法

　　检测计划：为了保证食品安全，工厂应该对生产环境中的病原微生物进行检测和评估，检测项目包括李斯特菌，沙门氏菌等病原体微生物，化验室应该按照一定的计划对生产场所环境中的病原体进行检测，其中包括地面、下水道、排水沟、墙壁、天花板、设备框架、运输的支架，冷藏装置、速冻机、传送带、设备的螺丝、维修工具等部位。当某个点检测到病员微生物时，应该对环境中的相似点加大检测频率;在把所有的预定点检测完后，应该对环境中的病原微生物的存在状况进行全面评估，在下一次环境检测循环过程中加强检测容易出现病原体的环境点，达到持续改进的目的。

　　检测频率:每月两次,每次每个区域至少选取5个检测点,分别进行检测。

　　3.3.1环境李斯特菌的检测方法(3MTM PetrifilmTM环境李斯特菌的测试片)

　　3.3.1.1用涂抹棒，海绵或者其他采样设备收集环境样本。

　　3.3.1.2将收集的样本添加10毫升灭菌的缓冲蛋白胨水，将样本与缓冲蛋白胨混合1分钟，将样品置于室温(20-30℃)1小时，最久不超过1.5小时，以修复损伤的李斯特菌。

　　3.3.1.3将测试片放在平坦处，掀起上层膜。

　　3.3.1.4用移液器垂直滴加3毫升样品到下层膜中央，将上层膜缓慢盖下，以免产生气泡。

　　3.3.1.5轻轻将塑料压板放在位于接种区上层膜上，不要压，扭转或者滑动压板。提起压板等至少十分钟，以使胶体凝固。

　　3.3.1.6将测试片透明面朝上，可叠放至十片，在37℃±1℃培养26-30小时，可以用标准菌落记数器或者其他光学放大器判读，不要记数圆形轮廓上的菌落，因为他们不受选择性培养基的影响。

　　3.3.1.7对于定性检测，根据紫红色菌落是否存在，结果记为检出或者未检出。

　　3.3.2环境中沙门氏菌的检测方法

　　3.3.2.1采样地点:选取采样点时因尽量选取微生物容易滋生的地方

冷冻车间		FD车间
东区初加工	传递窗口表面、排水沟、排水沟出口、墙壁、地面	卸料间	墙壁、墙角、地面、天花板、物料车表面
东区精加工	地面、墙壁、墙角、排水沟、排水沟出口、速动机链条、天花板	暂存间	墙壁、地面、天花板、墙角、墙缝
西区初加工	传递窗口表面、地面、墙壁、排水沟、排水沟出口	挑选间	墙壁、地面、天花板、墙角、垫板
西区精加工	地面、墙壁、墙角、排水沟、排水沟出口、速动机链条、天花板	包装室	墙壁、地面、天花板、金探传送带表面、落地料存放处

　　3.3.2.2操作步骤

　　3.3.2.2.1采样应在生产开始后进行，用已浸润过的棉拭在选定的被测表面旋转涂抹约100cm2的面积，然后将棉拭放回涂抹试管并盖紧。

　　3.3.2.2.2将样品带回实验室，每5个点混合成一个样品,登记编号,按照SN0170-92标准及时检测，若有阳性结果出现，应逐步对所混合的每个点分别检测。

　　物体表面涂抹菌落总数计算方式：物体表面细菌总数(cfu/c㎡)=平皿上菌落的平均数*采样液稀释倍数/采样面积(cm2)

　　根椐GB15979-2002《一次性卫生用品卫生标准》的标准,生产环境卫生指标

　　1装配与包装车间空气中细菌菌落总数应≤2 500 cfu/m3。

　　2工作台表面细菌菌落总数应≤20 cfu/cm2。

　　3.工人手表面细菌菌落总数应≤300 cfu/只手，并不得检出致病菌。

　　人员和环境卫生检测方法

　　一、空气采样及检验方法

　　1培养基：普通营养琼脂平板，按GB4789.28中3.7条配制

　　2采样(空气沉降法)

　　2.1布点：面积小于30平方米的车间，设一对角线，在线上取3点，即中心一点，两端在距墙1米处各取一点;面积大于30平方米的车间，设东、西、南、北、中5个点，其中东、西、南、北点均距墙1米。

　　2.2采样高度：与地面垂直高度80-150厘米。

　　2.3采样方法;用直径为9厘米的普通营养琼脂平板在采样点上暴露20分钟盖上送检培养。

　　3培养：于37℃培养24小时。

　　4检测频率：每周

　　空气质量标准：

　　生车间、熟车间、成品车间：低于100个

　　半成品库、成品库：低于10个

　　二、设备的采样与检验方法

　　根据生产过程所要求的重点卫生部位，实验室对其进行涂抹采样，进行细菌总数检验。

　　1采样方法

　　1.1涂抹法(适用于表面平坦的设备和工器具产品接触面)

　　取经过灭菌的铝片框(框内面积为50平方厘米)放在需检查的部位上，用无菌棉球蘸上无菌生理盐水擦拭铝片中间方框部分，擦完后立即将棉球投入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。

　　1.2贴纸法(适用于表面不平坦的设备和工器具接处面)

　　将无菌规格纸(5×5厘米，纸质要薄而软)用无菌生理盐水泡湿后，于需测部分分别贴上两张，两张纸面积共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。

　　2检验方法

　　2.1细菌总数的检验

　　将上述样液充分振摇，根据卫生情况，相应地做10倍递增稀释，选择其中2-3个合适的稀释度作平皿倾注培养，培养基用普通营养琼脂，每个稀释度作2个平皿，每个平皿注入1毫升样液，于37℃培养24小时后计菌落数。

　　结果计算

　　表面细菌总数(cfu/cm2)=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数/30×2

　　2.2致病菌的检验

　　沙门氏菌，参照GB4789.4进行

　　金黄色葡球菌，参照GB7918.5进行

　　4.检验合格标准：细菌总数10-100个∕cm2，

　　5.关键点：细菌总数≤10个∕cm2

　　一般区域：细菌总数≤100个∕cm2

　　三、人员手表面细菌污染情况的检验

　　1. 采样方法：用一支蘸有无菌生理盐水的棉拭子涂擦被检对象手的全部，反复两次，涂擦的时候棉拭子要相应地转动，擦完后，将手接触部分剪去，将棉拭子放入装有10毫升无菌生理盐水的试管内送检培养。

　　2. 检验方法：同工器具表面细菌总数检验方法。

　　3. 结果计算：每只手表面的细菌总数(cfu/只手)=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数

　　四、消毒液药效的微生物学鉴定法

　　1采样对象：正常使用的消毒液，和已知配制好备用的消毒液

　　2采样及检验方法

　　在无菌条件下，用无菌吸管吸取1毫升样液，加入9毫升稀释液中混匀，对于醇类与酚类消毒剂，稀释液用普通营养肉汤即可;对于含氯消毒剂、含碘消毒剂，需在肉汤中加入0.1%硫代硫酸钠，对洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在肉汤中加入3%(W/V)土温80和0.3%卵磷脂;对醛类消毒剂，需在肉汤中加入0.3%甘氨酸;对于含有表面活性剂的各种复方消毒剂，需在肉汤中加入(W/V)土温80，以中和被检样液中的残效作用，

　　将注入了样液的稀释液充分摇匀，取1毫升注入平皿，随之倒入普通营养琼脂，待琼脂凝固后，翻转平皿，将平皿于37℃条件下培养24小时后计平板上生长的菌落数。

　　3结果分析

　　平板上有菌生长，表明被检样液中有残存活菌，若每个平板菌落数在10个以下，仍可用于消毒，若每个平板菌落数超过10个，说明每毫升被检样液含菌量已超过100个，即不宜在用于消毒。

　　该公式是一个经验公式.它的理论模式依据是:100CM2的面积上10MIN降落的菌落数,

　　等于1升空气中所含的细菌总数.系数50000基于上述假说和单位换算而来.

　　细菌总数(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT

　　5/10T:实际放置了5MIN;

　　100/A:A单一培养皿面积;

　　1000:1M3=1000L啊,换算成m3

　　1、空气细菌落菌数单位既然是cfu/m3，那采样时应该还要记录放置平皿的高度。

　　2、食品安全管理体系中罐头行业有个标准如下：

　　落下菌数空气污染程度评价