□李炜 韦素梅 刘运龙 广西壮族自治区粮油科学研究所
　　摘 要: 将氯霉素多克隆抗体与琼脂糖凝胶偶联,制备了对氯霉素有特异性吸附作用的微型氯霉素免疫亲和色谱柱，并对色谱柱进行了评价。该微型氯霉素免疫亲和色谱柱的动态柱容量为52720μg/L，富集极限可以达到100ng/L，对氯霉素的回收率达到98.5%以上，可以重复使用2次。该色谱柱可以有效消除基质的影响, 提高检测的灵敏度,可应用于乳制品等食品中氯霉素残留的样品快速前处理。
　　关键词:氯霉素 免疫亲和柱 检测
　　氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一种广谱抗生素。医学临床和兽医曾用来治疗人及动物的多种感染性疾病。但氯霉素对造血系统有严重的毒副作用[1, 2]，已被临床医学和动物生产上禁止使用。我国规定在动物可食用组织不得检出[3]。但由于氯霉素价格低廉，效果明显，仍存在违规使用、屡禁不止的情况，导致食品中氯霉素的残留现象依然十分严重[4]，对人体健康危害极大。
　　目前检测食品中氯霉素残留的方法主要包括:薄层层析法、高效液相色谱法[5]、气相色谱法[6-8]、和液相色谱-质谱法[ 9, 10]、气相色谱-质谱法等[11]、免疫学检测方法等[12-14]。无论何种检测方法，对样品纯度的要求较高,检测前必须对样品进行净化处理。由于生物样本成分复杂，残留的氯霉素浓度低，且大多数取样量少，常规的样品前处理方法繁琐、耗时长、成本高。免疫亲和色谱(IAC)是以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为原理的色谱技术，最显著优点在于对待测物的高效、高选择性保留能力，特别适用于复杂样品痕量组分的净化与富集[15-17]。使用免疫亲和色谱纯化富集样品中的氯霉素，可以很大程度的简化和加快检测流程，提高分析结果的准确性、可靠性和分析的极限。
　　本文中研制的微型氯霉素免疫亲和色谱柱具有浓缩待测样品中氯霉素浓度、降低检测下限、排除杂质干扰、提高检测结果的准确性和可靠性、减少样品过柱时间的作用，为氯霉素的分析检测提供了快速高效的前处理手段。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要试剂与仪器
　　氯霉素多克隆抗体(南宁市蓝光生物技术有限公司);过碘酸氧化的琼脂糖凝胶(sigma，A9951);硼氢化钠(分析纯);碳酸钠(分析纯);氯霉素标准品(Sigma，C0378);氯霉素氘代内标(氯霉素-D5);0.01mol/L磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液(PBS),pH7.4;洗涤液为含0.05% Tween-20的PBS溶液(PBST);洗脱液(3%乙酸-80%甲醇水溶液);饱和tris溶液;色谱纯甲醇;色谱纯乙腈;色谱纯正己烷;色谱纯正丙醇。
　　分析天平(上海天平仪器厂);可调试移液器(美国雷勃公司);旋转蒸发仪(上海荆和分析仪器有限公司);离心机(上海安亭科学仪器厂);涡旋混合器(德国IKA集团) ;液相色谱-质谱/质谱(美国AB SCIEX公司)。
　　1. 2 试验方法
　　1.2.1 免疫亲和柱的制备
　　用50mL浓度为0.1mol/L碳酸钠溶液溶解1g氯霉素多克隆抗体，与40mL的过碘酸氧化的琼脂糖凝胶在室温下反应30min后，于4℃冰箱静置30min，然后加入50mg硼氢化钠还原稳定，清洗后，得到富集氯霉素的免疫亲和色谱填料。取25μL填料装入容量为0.25mL的亲和层析塑料柱中，填料两头分别加上1个孔径为50μm的筛板，筛板刚好与填料接触后得到微型富集氯霉素的免疫亲和色谱柱。往柱里加入100μL甘油，3-8℃下保存，待用。
　　1.2.2 免疫亲和柱的使用方法
　　将氯霉素亲和柱取出，室温平衡10min后依次加入1mL PBST、2mL PBS、200μL 洗脱液、1mL PBST清洗柱子，用5mL PBS平衡柱子后加入待测样品，自然重力下流出，弃去流出液，待样品滴净后，依次加入2mL PBST、2mL PBS清洗，然后加入适量洗脱液(0.2mL—1mL)，用2mL的离心管收集洗脱液，待测。
　　1.2.3 样品的加标回收
　　称取阴性牛奶样品5g(精确至0.01g),置于50ml离心管中，加入100ng氯霉素标准品和等量的氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)，混匀后加入乙腈30mL,匀浆，离心5min。将上清液移250mL的分液漏斗中，加入15mL的乙腈饱和的正己烷，振荡5min，静置分层，转移乙腈层至100mL的圆底烧瓶中，残渣中再加入30mL的乙腈，振摇3min，离心5min，取上清液转移到同一分液漏斗中，振荡5min，静置分层，转移乙腈层至同一圆底烧瓶中。向烧瓶中加入5mL正丙醇，于40℃水浴中旋转蒸发近干，分次加入15mL PBS溶解,全部转移至离心管中，取饱和tris溶液调节提取液使pH值接近中性，待亲和柱净化。
　　1.2.4 检测方法
　　按照GB/T22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定方法，采用液相色谱-质谱/质谱测定洗脱液中的氯霉素含量。
　　2 结果与分析
　　2.1 容量试验
　　将氯霉素标准品用PBS配制成5mL浓度为2μg/mL的氯霉素溶液作为待测样品，待测样品过柱后加入1mL洗脱液洗脱，检测洗脱液中氯霉素质量，计算出动态柱容量(指每毫升填料对氯霉素的最大吸收值)。上述实验重复3次，结果见表1。 　　3次重复实验的结果表明，该25μL的微型氯霉素免疫亲和色谱柱的平均动态柱容量为1.318μg/25μL，即52720μg/L 填料。说明该微型氯霉素免疫亲和色谱柱的吸附能力很强，能有效富集氯霉素分子。
　　2.2 极限试验
　　将氯霉素标准品用PBS配制成10mL浓度分别为100ng/L、200ng/L 的氯霉素溶液作为待测样品，并以10mL PBS作为空白待测样品。待测样品分别过柱后加入0.2mL洗脱液洗脱，将洗脱液定容至1mL后，检测洗脱液中氯霉素的质量，测试微型氯霉素免疫亲和色谱柱的富集极限。上述实验重复2次，结果见表2。 　　由上表可以看出，该微型氯霉素免疫亲和色谱柱的富集极限可以达到100ng/L，即0.1ppb，样品经色谱柱富集浓缩后，样品浓度由由原来的100ng/L、200ng/L富集到1001ng/L、2430ng/L，富集率可达10倍。在仪器检出限不变的情况下, 使用该色谱柱可以使样品分析方法的检出限降低10倍。
　　2.3 回收率试验
　　将氯霉素标准品用PBS分别配制成100mL浓度为100ng/L、20mL浓度为500ng/L、4mL浓度为2.5μg/L的氯霉素溶液作为待测样品，并以20mL PBS作为空白待测样品。待测样品分别过柱后加入0.2mL洗脱液洗脱，检测洗脱液中氯霉素的质量，计算回收率。上述实验重复2次，结果见表3。 　　由上表可以看出，该微型氯霉素免疫亲和色谱柱对氯霉素的回收率较高，达到了98.5%以上。
　　2.4 使用次数试验
　　将氯霉素标准品用PBS配制成10ml浓度为1000ng/L的氯霉素溶液作为待测样品，待测样品过柱后加入0.2mL洗脱液洗脱。同一根微型柱使用1次之后再重复使用2次，总共使用次数为3次。分别收集每次过柱后的洗脱液，检测洗脱液中氯霉素的质量。上述实验重复3次，结果见表4。
　　由上表可以看出，随着使用次数的增多，微型氯霉素免疫亲和色谱柱的回收率逐渐下降，在使用第3次后其回收率均明显下降，因此该微型氯霉素亲和色谱柱最多可以使用2次。
　　2.5 样品加标回收试验
　　将添加了氯霉素标准品和等量氯霉素-D5的待测牛奶样品过柱后加入0.3mL洗脱液洗脱，洗脱液经0.45μm的滤膜过滤后，检测洗脱液中氯霉素的质量，计算回收率。上述实验重复3次，并设一个空白对照，结果见表5。
　　以上实验结果表明，该微型氯霉素免疫亲和色谱柱可以有效的富集牛奶中的氯霉素，消除牛奶基质对仪器检测氯霉素的影响，具有较好的回收率。
　　3 小结
　　实验证明，本文研制的微型氯霉素免疫亲和色谱柱对氯霉素具有很高的富集率、灵敏度和回收率，可以消除样品杂质的影响，将样品中的氯霉素富集10倍以上，对氯霉素的吸附容量达到52720μg/L填料，富集极限可以达到100ng/L，回收率达到98.5%以上，可以重复使用2次。
　　微型氯霉素免疫亲和色谱柱具有很强的氯霉素结合力，可选择性吸附样品液中的氯霉素，从而对氯霉素样品起到特异性纯化和富集的作用。由于填料的吸附容量大，填料装柱体积少(25μL)，样品过柱洗脱的时间短，洗脱体积少，洗脱液既可以直接结合ELISA测试盒或胶体金试纸条进行检测，也可以直接联合液相色谱等仪器分析方法进行精确定量。使用微型氯霉素免疫亲和色谱柱可以高效、可靠、快速简便的富集氯霉素，改善信噪比，提高检测方法的准确度。
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