□ 王乃强 李从从 杨海军 保龄宝生物股份有限公司

　　王彩梅 王明珠 山东省功能糖提取与应用技术重点实验室

　　玉米是世界上三大粮食作物之一，玉米深加工产业拥有巨大的市场潜力。玉米蛋白粉是玉米深加工的重要副产物之一，由于其气味独特、色泽鲜艳、水溶性差，目前绝大部分均制成畜禽饲料或者随着废水被排掉，并未得到很好的开发，这样既浪费了宝贵资源，又造成严重的环境污染。玉米蛋白粉俗称玉米黄粉，主要成分为玉米蛋白，其蛋白质含量高达60%以上，除此以外还含有少量的淀粉、脂肪、纤维类胡萝卜素。利用玉米黄粉可提取天然食用色素、玉米醇溶蛋白及谷氨酸等，还能制备具有多种生理功能的玉米活性肽，如谷氨酰胺肽、高F值低聚肽、降血压肽和玉米蛋白肽等。

　　玉米活性肽是玉米蛋白经过酶解分离提取而成，根据分子量不同其活性也有所不同。其中低聚肽混合物由2～6个氨基酸组成，分子量集中在200～1000，可以不经肠胃消化而被直接吸收，完全可以应用在食品中。新近研究发现玉米肽富含支链氨基酸，具有在肌肉中促进蛋白质合成和抑制蛋白质分解的作用，可以用于运动员食品和临床营养品；玉米肽含有大量丙氨酸，可使减缓身体吸收乙醇的速度并促进酒精代谢，大大减少饮酒引起的急性酒精中毒。此外，玉米肽还具有降血压、降血脂，辅助治疗肝病和乳腺癌的生理活性作用。因此，开发玉米肽已成为玉米综合利用研究的新热点。

　　制备玉米活性肽，首先通过连续逆流超声技术提取玉米蛋白粉中的醇溶蛋白，对提取物进行水解并优化各项工艺参数，同时采用二级膜分离水解物，可以得到两种纯度较高的不同分子量玉米活性肽产品。

　　制备玉米活性肽工艺

　　1.材料

　　玉米蛋白粉（蛋白质含量60%，市售）、蛋白酶Alcalase（诺维信公司） 、  NaOH、HCL、甲醛、乙醇。

　　2.仪器

　　恒温水浴锅、分析天平、分光光度计、酸度计、温度计、膜过滤装置，连续逆流超声提取装置、万用电炉等。

　　3.方法

　　（1）氨基氮测定方法

　　采用甲醛滴定法，在参照GB/T 5009.39-2003的基础上略有改动，操作如下：将水解液在5000r/min下离心10min，取2mL上清液于三角瓶中，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定到pH值8.2，加入4mL37%的甲醛溶液（提前用0.1mol/L的NaOH调到pH=8.2），再用0.01mol/L的NaOH溶液滴定到pH=9.2，记录加入甲醛后把溶液滴定到pH=9.2所消耗碱量，空白对照用蒸馏水代替样品，采用pH计测量pH值。

　　采用以下公式计算氨基氮：

　　h = [（V1-V0）×NNaOH×14.008]/2

　　式中h-样品中氨基酸含量；

　　V1-滴定样品消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（mL）；

　　V0-滴定空白消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（mL）；

　　NNaOH-氢氧化钠标准滴定溶液的浓度（mol/L）。

　　（2）水解度的计算方法

　　采用以下公式计算水解度

　　水解度（DH）=（h1- h0）/htot

　　式中 h1-测得水解液中氨基氮含量（mg/mL）；

　　h0-测得玉米蛋白粉混悬液中氨基氮含量（mg/mL）；

　　htot-每毫升水解液中总氮含量（mg/mL）。

　　4.工艺流程

　　工艺流程具体如下所示：

　　结果与讨论

　　1.玉米蛋白粉的预处理

　　本研究首先对玉米蛋白粉进行粉碎，以有利于目的产物的提取和分离，然后采用连续逆流超声提取技术提取玉醇溶蛋白的提取率。在玉米蛋白粉过40目筛，超声波频率40kHz，温度为40℃的条件下研究乙醇的浓度、乙醇-水溶液pH值、料液比和提取时间这4个因素对玉米醇溶蛋白提取率的影响进行正交试验，确定最佳提取工艺条件，实验设计如表1所示。

　　正交试验结果及分析如表2所示。

　　由正交试验结果分析表明，极差R的大小决定因素影响的主次顺序为：RA>RB>RD>RC。此外由k值可知，最佳组合水平为A1B2C3D2，经实验得知在此组合下玉米醇溶蛋白提取率为43.96%。因此，连续逆流超声提取玉米醇溶蛋白的最佳工艺条件为：以pH8.0、浓度75%的乙醇作萃取液，玉米蛋白粉过40目筛，料液比1∶6，在温度40℃、超声频率40kHz的条件下提取1h，玉米醇溶蛋白的提取率达到43.9%。

　　2.蛋白酶水解玉米醇溶蛋白工艺条件的确定

　　以底物浓度、酶浓度、酶解时间3个可能影响水解度的因素做单因素优化实验，确定蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最优工艺条件。

　　（1）底物浓度对水解度的影响

　　在酶浓度3.0%、温度50℃、pH8.5的条件下，水解1h，选择不同质量浓度3%、3.5%，4%、4.5%，5%、5.5%，6%的玉米醇溶蛋白，记录不同底物浓度下水解度的变化，作底物浓度与水解度的关系曲线。

　　由图1可以看出，随着底物浓度的增加，水解度逐渐上升，当底物质量浓度达到5％时，水解度最大；当底物质量浓度大于5％时，随着底物质量浓度的增加，水解度反而降低，其原因可能是底物质量浓度增大后，蛋白不能充分与酶接触，影响了酶对蛋白的作用，因此，酶解反应的底物浓度以5％为佳。

　　（2）酶浓度对水解度的影响在底物浓度5.0%、温度50℃、pH8.5的条件下，水解1h，选择酶浓度1%、2%、3%、4%、5%，6%记录不同酶浓度对水解度的变化，做出酶浓度与水解度的关系曲线。

　　由图2可以看出，酶浓度为3%时，水解度最大；随着酶浓度的增加，水解度并非成正比例的增大。因此，仅增酶浓度来提高水解度效果不显着。由此可以确定酶解反应的最适酶浓度为3%。

　　（3）酶解时间对水解度的影响

　　在底物浓度5.0%、酶浓度3%、温度50℃、pH8.5的条件下，选择不同的酶解时间0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，3h，3.5h记录不同酶解时间对水解度的变化，做酶解时间与水解度的关系曲线。

　　由图3可以看出，反应开始时，水解度随着时间的延长而明显升高；但1h以后，水解度变化不是很明显。由此可以确定最佳水解时间为1h。

　　综合以上实验结果，在试验中我们选用碱性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白的条件为：玉米醇溶蛋白浓度调至5%，用0.1mol/L的氢氧化钠调至pH8.5，酶浓度3%，在50℃条件下保持1h。反应过程中用1mol/L氢氧化钠调pH值，在此条件下醇溶蛋白水解度可达到41.82%。

　　3.精制

　　将酶解液灭酶离心分离，提取液用活性炭进行脱色，然后采用二级膜分离对没解产物进行分离，首先采用截留分子量为10000～30000Da超滤膜分离提纯，然后采用纳滤膜分离浓缩。最终得到两种不同分子量范围的玉米活性肽：浓缩液中玉米活性肽分子量在3000～6000 Da之间的达到80%以上，透过液中分子量在1000Da以下的达到90%以上。再经离子交换、浓缩、干燥得到最终的玉米活性肽产品。

　　图4为先后经过超滤和纳滤后透过液中玉米活性肽的分子量分布图。直接酶解后的产物分子量主要集中在200～10000Da，这部分约占整个峰面积的90％以上，其中分子量在200～6000Da约占78％；分子量大于10000Da的约占8％。这部分应该是未被水解的蛋白质；分子量小于200Da的约占2％。经超滤后有效地将分子量在10000Da以上的大分子量物质去除，酶解液的分子量均在10000Da以下。其中分子量在2000～6000Da约占85％，200～2000Da的部分约占11%，分子量小于200Da的约占4％。超滤后透过液再经进一步纳滤，获得两种不同分子量的活性肽产品。其中透过液中分子量范围在1000Da以内的活性肽含量占到90%以上，截留液中分子量范围在3000～6000Da的活性肽含量在88%以上，有效保证了活性肽产品的活性。

　　总 结

　　本文对制备玉米活性肽的工艺进行了研究，分别从预处理、酶解、精制3个主要的方面进行了研究，得到了以下结论：

　　（1）确定了以玉米蛋白粉为原料制备玉米活性肽产品的工艺路线。

　　（2）利用连续逆流超声提取设备提取玉米醇溶蛋白的最佳工艺条件：以pH8.0、浓度75%的乙醇作萃取液，玉米蛋白粉过40目筛，料液比1∶6，在温度40℃、超声频率40kHz的条件下提取1h，玉米醇溶蛋白的提取率达到43.96%。

　　（3）蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白的最佳工艺条件为：将玉米醇溶蛋白浓度调至5%，用0.1mol/L的氢氧化钠调至pH8.5，酶浓度3%，在50℃条件下保持1h，水解度可达到41.82%，反应过程中用1mol/L氢氧化钠调pH值。

　　（4）酶解后产品采用超滤、纳滤分离，得到两种分子量相对集中的活性肽产品，一种分子量范围在3000～6000Da之间的玉米活性肽含量达到88%，另一种分子量范围在1000Da以下的玉米活性肽含量达到90%。

　　通过本文的研究，得出了一条制备玉米活性肽产品的可行工艺路线，首先得到较高提取率的玉米醇溶蛋白，酶解后生产出两种不同分子量的玉米活性肽产品，实现了在同一生产工艺中生产两个甚至多个高附加值产品，提高原料利用率，以创造更大的经济效益、社会效益。
来源：食安中国