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进出口乳及乳制品中沙门氏菌
快速检测方法 实时荧光PCR法
２０１００１１０发布２０１００７１６实施
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局发布
前 言
本标准的附录Ａ 为规范性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共
和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：袁飞、郑海松、邵碧英、杨海荣、祝长青、赵贵明、张菲菲、赵勇胜、吴亚君、黄文胜、
陈颖、徐宝梁。
本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。
进出口乳及乳制品中沙门氏菌
快速检测方法 实时荧光犘犆犚法
１ 范围
本标准规定了进出口乳及乳制品中沙门氏菌的实时荧光ＰＣＲ 检测方法。
本标准适用于进出口乳及乳制品中沙门氏菌的快速检测。
２ 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
ＧＢ／Ｔ４７８９。４ 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验
ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析试验室用水规格和试验方法
ＳＮ／Ｔ１１９３ 基因检验实验室技术要求
３ 缩略语
下列缩略语适用于本标准。
３。１
聚合酶链式反应。
３。２
实时荧光
实时荧光聚合酶链式反应。
３。３
脱氧核糖核酸。
３。４
脱氧核苷酸三磷酸。
３。５
脱氧腺苷三磷酸。
３。６
脱氧胞苷三磷酸。
３。７
脱氧鸟苷三磷酸。
３。８
脱氧胸苷三磷酸。
３。９
十六烷基三甲基溴化铵。
３。１０
三（羟甲基）氨基甲烷。
３。１１
乙二胺四乙酸。
３。１２
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
４ 实验条件的一般要求
实验过程中的措施按照ＳＮ／Ｔ１１９３中的规定执行，以防止交叉污染。
５ 测定方法
５。１ 方法提要
乳及乳制品经增菌后，取增菌液１ｍＬ 加到１。５ｍＬ 无菌离心管中，８０００犵离心５ｍｉｎ，尽量吸弃上
清液；提取ＤＮＡ，取ＤＮＡ 模板进行荧光ＰＣＲ 扩增，观察荧光ＰＣＲ 仪的实时曲线，对乳及乳制品中的沙
门氏菌进行快速检验。
５。２ 试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。所有试
剂均用无ＤＮＡ 酶污染的容器分装。
５。２。１ 检测用引物（对）序列
５’ＧＣＧＴＴＣＴＧＡＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＴＡＡ３’
５’ＣＧＴＴＣＧＧＧＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡ３’
引物（对）１０μｍｏｌ／Ｌ。
５。２。２ 探针
５’ＦＡＭＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴＡＭＲＡ３’
１０μｍｏｌ／Ｌ。
５。２。３ 犜犪狇ＤＮＡ 聚合酶。
５。２。４ ｄＮＴＰ：１００ｍｍｏｌ／Ｌ。
５。２。５ 核酸裂解液：２％ＣＴＡＢ，１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ盐酸（ｐＨ８。０），１。４ ｍｏｌ／Ｌ 氯化钠，２０ ｍｍｏｌ／ＬＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８。０）。
５。２。６ １０×ＰＣＲ 缓冲液：１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ盐酸（ｐＨ８。３），５００ｍｍｏｌ／Ｌ 氯化钾，１５ｍｍｏｌ／Ｌ 氯化镁。
５。３ 仪器和设备
５。３。１ 实时荧光ＰＣＲ 仪。
５。３。２ 离心机：最大离心力≥１６０００犵。
５。３。３ 微量移液器：１０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ。
５。３。４ 恒温培养箱：３６ ℃±１ ℃。
５。３。５ 恒温水浴箱：８０ ℃±０。５ ℃。
５。３。６ 冰箱：２ ℃～８ ℃，－２０ ℃。
５。３。７ 高压灭菌器。
５。３。８ 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
５。３。９ ｐＨ 计。
５。３。１０ 天平：感量０。０１ｇ。
５。４ 检验程序
检测程序见附录Ａ 图Ａ。１。
５。５ 步骤
５。５。１ 取样和增菌
取样前消毒样品包装的开启处和取样工具，无菌称取样品２５ｇ加入装有２２５ｍＬ 预热到４５ ℃的灭
菌水的三角瓶中，使样品充分混匀，３６ ℃±１ ℃培养１８ｈ～２２ｈ。
分别移取培养１８ｈ～２２ｈ的悬液各１０ｍＬ 加入９０ｍＬ 缓冲蛋白胨水中，３６ ℃±１ ℃培养１８ｈ～
２２ｈ。
５。５。２ 模板犇荦犃准备
每瓶培养的缓冲蛋白胨水分别取１ｍＬ 加到１。５ｍＬ 离心管中。１３０００犵～１６０００犵离心２ｍｉｎ，去
上清液。加入６００μＬ 核酸裂解液，重新悬浮起来。１００ ℃ 水浴５ ｍｉｎ 后，冷却至室温。１３０００犵～
１６０００犵离心３ｍｉｎ，将上清液移至干净的１。５ｍＬ 离心管中。加入０。８倍体积的异丙醇，放入冰箱静置
１ｈ或过夜。１３０００犵～１６０００犵离心２ｍｉｎ，去上清液，吸干。７０％乙醇轻柔倒置几次洗涤，１３０００犵～
１６０００犵离心２ｍｉｎ，小心去上清液。吸干，风干１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ。１００μＬ 双蒸水４℃保存（如不能及时
检验，放置－２０ ℃保存）。
也可以使用经过评估的等效的细菌核酸提取试剂盒。
５。５。３ 犇荦犃浓度和纯度的测定
取适量ＤＮＡ 溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测
２６０ｎｍ 和２８０ｎｍ 处的吸收值。ＤＮＡ 的浓度按照式（１）计算。
犮＝犃２６０ ×荦×５０ ……（１ ）
式中：
犮———ＤＮＡ 浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；
犃２６０———２６０ｎｍ 处的吸光值；
荦———核酸稀释倍数。
当浓度为１０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ，犃２６０／犃２８０比值在１。７～１。９之间时，适宜于实时荧光ＰＣＲ 扩增。
５。５。４ 实时荧光犘犆犚检测
反应体系总体积为２５μＬ，其中含：１０×ＰＣＲ 缓冲液２。５μＬ，引物对（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，ｄＮＴＰ
（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，犜犪狇ＤＮＡ 聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０。５μＬ，探针１μＬ，水１６μＬ，模板ＤＮＡ２μＬ（浓度约
１０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ）。反应步骤一：９４℃预变性１ｍｉｎ。反应步骤二：９４℃变性５ｓ，６０℃退火延伸
２０ｓ，３０个循环。
检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以沙门氏菌纯培养物提取的ＤＮＡ 为阳性对
照，以大肠杆菌或其他非沙门氏菌属肠杆菌纯培养物提取的ＤＮＡ 为阴性对照，以灭菌水为空白对照。
样品设３个重复，对照设２个重复，以Ｃｔ平均值作为最终结果。
６ 结果判断及报告
６。１ 犘犆犚体系有效性判定
空白对照：无荧光对数增长，相应的Ｃｔ＞２５。０。
阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ｃｔ＞２５。０。
阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ｃｔ＜２５。０。
以上三条有一条不满足，实验视为无效。
６。２ 检测结果判定
在符合６。１的情况下，被检样品进行检测时：
如有荧光对数增长，且Ｃｔ≤２５，则判定为被检样品筛选阳性。
如无荧光对数增长，且Ｃｔ＝３０，则判定为被检样品筛选阴性。
如２５＜Ｃｔ＜３０，则重复一次。如再次扩增后Ｃｔ仍为＜３０，则判定沙门氏菌筛选阳性；如再次扩增
后无荧光对数增长，且Ｃｔ＝３０，则判定沙门氏菌筛选阴性。
筛选阴性的被检样品报告未检出，筛选阳性的被检样品，按照传统检测方法ＧＢ／Ｔ４７８９。４进行确
证，报告以传统检测结果为准。
(责任编辑：admin)
