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中华人民共和国商业部部标准SB 115-82 代替SB 3306-66
本标准适用于冰蛋品的肠道致病菌大肠菌群及细菌数的检验。
1 取样方法
1.1 批的划分 以接触蛋液的工具、设备彻底消毒一次时的生产数量为一批。巴氏消毒的冰蛋可按 生产量的大小每隔1～4小时奖巴氏消毒器冲洗消毒一次,每两次冲洗之间,按顺序划为2～4批,如发现致病菌时,本批即不合格,前面的批可不受牵连,后面的批予以复验,按复验结果处理。
1.2 采样数量 按生产批号,在装听时流动取样。
1.2.1 检验肠道致病菌时,分蛋(冰鸡蛋黄、冰鸡蛋白)及冰鸡全蛋,取样按每250公斤取样一次,量约100克,每500公斤取样二次,合为一个检样；巴氏消毒冰鸡全蛋取样按500公斤取样一次,每1000公斤取样二次,合为一个检样。
1.2.2 检验细菌数、大肠菌群时,在每批装听过程前、中、后流动取样,每批合为一个检样。
1.3 用具
a. 电钻与钻头；
b. 玻璃漏斗或铝制漏斗；
c. 密封式250克敞口玻璃瓶。
注：上项用具在使用前应在160～180℃ 的温度下干燥消毒2小时。抽样钻头每抽取样品一批后应以75％酒精进行浸泡消毒。
1.4 方法
1.4.1 在生产过程中灌取流动样品的敞口扦样瓶(罐),随该批产品入冷冻室,冷冻完毕后作细菌检验使用。
1.4.2 成品钻样时,先将铁听开口处的外部用75％的乙醇进行消毒,而后将盖启开,用电钻由顶至底斜角钻入,徐徐钻出样品,然后抽出电钻,就中取约200克于扦样瓶(罐)中,封实后准备检验。
2 检验方法
2.1 肠道致病菌的检验
2.1.1 试样制备：将盛冰蛋的样品瓶浸泡冷水中(谨慎小心,勿使水浸入瓶内)使样品融化后取出,充分摇和均匀。
2.1.2 增菌培养：以无菌操作,由每瓶样品中采取一个试样,接种于亚硒酸盐煌绿增菌培养基中(此培养基预先置于盛有约30粒3～4毫米直径玻璃珠的灭菌玻璃瓶内) 盖紧瓶盖,振荡均匀,使检样与培养基充分溶和,然后放入37℃定温箱中培养18～24小时。培养基数量及样品数量按表1规定：
表 1
培 养基 名 称 接种试样数量 培养基数量
亚硒酸盐煌绿 30克 150毫升
2.1.3 分离培养:经过增菌后,接种于远藤氏或伊红美蓝培养基一个,及去氧胆酸盐枸橼酸盐或S·S琼脂培养基一个,置37℃培养箱中,对鉴别培养基培养24小时, 对选择性培养基培养48小时,然后观察结果。如无可疑菌落即可做阴性结果的报告,如有可疑菌落则在每个平皿上挑取2～3个菌落接种于三醣铁琼脂斜面培养基上,再于37℃培养箱中培养18～24小时,然后按表2作初步鉴定。
三醣铁琼脂斜面培养基反应与鉴别见表2:
表 2
反 应 鉴 别
底 层 斜 面 硫 化 氢 非沙门氏菌属及志贺氏菌属
(可作为报告的依据)
○＋ ＋ ＋
○＋ ＋ －
＋ ＋ －
－ － ＋
－ － －
＋ － ＋ 可疑为沙门氏菌属
○＋ － ＋
○＋ － －
＋° － － 可凝为沙门氏菌属及志贺氏菌属
＋ － －
注:○＋表示产酸产气反应。 ＋°表示微量产酸产气反应。＋表示产酸或产硫化氢。－表示不产酸不产气,不产硫化氢
2.1.4 生化及血清学鉴定。
2.1.4.1 生化试验:
三醣铁琼脂斜面培养基属可疑沙门氏菌属的反应者,则可再行接种一套生化试验(也可以先进行血清凝集试验)：属可疑志贺氏菌属的反应者,先进行血清凝集试验,必要时再进行生化试验,其反应如表3。
沙门氏菌属生化反应与鉴别见表3:
表 3 项 目 反 应
硝 酸 盐 还 原
尿 素 不 分 解
靛 基 质 不 产 生
乳 糖 不 发 酵
甘 露 醇 发 酵
蔗 糖 不 发 酵
水 杨 素 不 发 酵
注:① 醣类发酵阴性反应者,应观察14日始得报告阴性
② 上列各项生化试验应同时进行接种。
志贺氏菌属反应与生化鉴别见表 4:
表 4 项 目 甘露醇 鼠李糖 木胶糖 乳 糖 靛基质
菌 别
志贺氏痢疾杆菌 － － - - -
史氏痢疾杆菌 － ＋ - - ＋
宋氏痢疾杆菌 ＋ + - ＋迟 -
福氏痢疾杆菌 ＋－ - - - －＋
注：① “＋”为阳性反应,“－”为阴性反应。
② 醣发酵阴性反应者,应观察14日始得报告阴性。
2.1.4.2 血清凝集试验:
a. 经表3生化试验而符合于沙门氏菌属的特性者,最后则进行血清学鉴定,即以沙门氏菌属多价诊断血清进行玻片凝集试验。
b. 玻片凝集试验,挑取在三醣铁琼脂斜面培养基中,疑似沙门氏菌落于洁净玻片的血清滴上,充分混合,使成乳液后,视其有无凝集现象,未见凝集发生者,可作阴性结果报告。如凝集细小不易辩别时,可用放大镜或低倍显微镜进行观察,为避免细菌有自凝现象起见,可在玻片另侧另加生理盐水作对照试验。
c. 如沙门氏菌多价血清有凝集现象者,则报告发现或检出沙门氏菌属,如必要分型者,则再行单价因子血清凝集及鞭毛因子血清凝集以确定其型别。
d. 在三醣铁琼脂斜面培养基中,疑似志贺氏菌属反应者,以志贺氏多价血清作凝集,凝集阳性时报告发现志贺氏菌属,必要时可以进行单价诊断血清鉴定,及生化试验以确定 其属宋氏、福氏或史氏痢疾杆菌。
e. 结果的判断与报告方法：
(a) 沙门氏菌属： 生化试验及血清学鉴定结果均符合沙门氏菌属之特点时,即报告为“发现沙门氏菌 属”。 生化试验结果符合沙门氏菌属的生化特性而血清学鉴定为阴性时,再进行“KCN试验”,如仍符合时,则报告“发现沙门氏菌属——未鉴定”,如不符合则报告为 “未发现沙门氏菌属”。 凡生化试验及血清学鉴定结果均不符合者,则报告为“未发现沙门氏菌属”。生化试验不符合者,应根据下列不同情况报告： 尿素或硝酸盐还原试验不符合者即可报告为“未发现沙门氏菌属”乳糖、蔗糖、水杨素、甘露醇及靛基质反应有两种或两种以上不符合者,即报告为“未发现沙门氏菌属”。靛基质试验阳性者或乳糖、蔗糖、水杨素任一种在两天或两天以上发酵或甘露醇反 应不符合者,则以单因子血清及其他生化试验作最后鉴定。
(b) 志贺氏菌属: 经血清学鉴定和生化试验为阳性者即报告为“发现志贺氏菌属”。血清学鉴定为阴性者,即报告为“未发现志贺氏菌属”。
2.2 细菌数检验法(平板培养数菌法)：
2.2.1 稀释及培养：
a. 以无菌手续充分摇动拌匀,以无菌吸管或玻管吸取均匀蛋液10～15克于250毫升无菌的玻璃瓶中(瓶内预先置入直径3～4毫米玻璃珠30粒左右),于每瓶中加入相当试样重 量9倍的灭菌生理盐水作成十倍稀释液,盖紧瓶盖以振荡均匀,使成乳剂。
b. 用1毫升灭菌吸管(1/10毫升刻度到尖端)吸取上项稀释液１毫升,注入预先备好的一列灭菌试管(每管内均盛有灭菌生理食盐水9毫升)的第一管中,作成百倍稀释液(此液需用该吸管吐数次使之混和均匀),然后再以该吸管吸取百倍稀释液1毫升注入预先备好的灭菌二重皿中,同样共接种二重皿三个。
c. 以另一灭菌吸管,由百倍稀释液中吸取1毫升加入预先备好的一列灭菌试管的第二管中,依上述方法作成千倍稀释液,并接种二重皿三个。
d. 依同法作成万倍十万倍五十万倍等稀释液(可根据具体情况作成适宜的稀释液3个,每个3列),并皆按上法进行接种,然后于每只二重皿内倾入已溶化的约45℃ 普通琼脂培养 基pH7.0(此培养基溶化后预置入45℃恒温水浴锅内)15～20毫升,轻轻转动二重皿,使培养基与稀释液混合均匀后静置不动。 e. 将上项作成的二重培养皿,等其凝固后,以皿底在上皿盖在下的倒置方式放入37℃培养箱中。
2.2.2 数菌法：
a. 以上项平板培养于48小时取出,选择其菌落在 30～300之间者为准,即以该稀释倍的三个平板培养分别计算其菌落数。
b. 将上项所得的三个平皿的菌落数,平均再乘以该稀释倍数,即得出该样品每克所含细菌数
2.2.3 报告法：
a. 按平板培养数菌法,检出1克中所含菌数以百或千为尾数作报告。 b. 应注明在37℃经48小时平板培养数菌法检查的结果。
2.3 大肠菌群检验法
2.3.1 稀释及培养：
a. 在进行前项菌数培养的同时,依次选择三种不同稀释液各取1毫升分别接种于乳糖胆盐发酵管中,对每种稀释液均作三列培养。
b. 将上项已接种的发酵管,轻轻摇动使混合均匀,然后一并置35～37℃培养箱中培养24±2小时。
2.3.2 结果的判断及报告方法：
a. 如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为“大肠菌群阴性”。
b. 如产气者,将产气的发酵管分别接种在伊红美蓝平板(也可采用远藤氏琼脂平板或麦康凯琼脂平板)上,置35～37℃培养箱内,培养18～24小时,然后取出。在上述平板上挑取大肠菌群可疑菌落1～2个进行革兰氏染色镜检,同时接种乳糖复发酵管,置35～37℃培养箱内,培养24±2小时,观察气产情况。
c. 凡乳糖复发酵管产气,革兰氏染色为阴性,无芽胞杆菌,即可报告为“大肠菌群阳性”；如乳糖不产气或革兰氏染色阳性,则报告“大肠菌群阴性”。
2.3.3 查表:根据证实为大肠菌群阳性的管数,按表5报告大肠菌群最近似数。每100毫升(克)检样中大肠菌群最近似数(M.P.N.)检索表
表 5
检 样 量 大肠菌群最近
似数个/100毫升(克)
10毫升(克)×3 1毫升(克)×3 0.1毫升(克)×3 0.01毫升(克)×3
0 0 0 0 0 1 2 3 0 3 6 10
1 1 1 1 0 1 2 3 4 7 12 16
2 2 2 2 0 1 2 3 9 15 20 30
3 3 3 3 0 1 2 3 25 45 110 250
0 0 0 0 0 1 2 3 0 30 60 100
1 1 1 1 0 1 2 3 40 70 120 160
2 2 2 2 0 1 2 3 90 150 200 300
3 3 3 3 0 1 2 3 250 450 1100 2500
0 0 0 0 0 1 2 3 0 300 600 1000
1 1 1 1 0 1 2 3 400 700 1200 3000
2 2 2 2 0 1 2 3 900 1500 2000 3000
3 3 3 3 0 1 2 3 2500 4500 11000 25000
注:表若不够用时,可依此类推。
3 培养基制备和血清生化试验
3.1 培养基制备法
3.1.1 亚硒酸盐煌绿增菌培养基:
3.1.1.1 材料: 蛋白胨 5克 酵母膏 5克 甘露醇 5克 牛磺胆酸钠(Sod,Taurocholeta) 1克亚硒酸氢钠(NaHSeO3) 4克 煌绿 0.005克 磷酸盐缓冲液(0.25克分子)(pH7.0) 100毫升蒸馏水900毫升最终酸碱度:用于冰蛋制品试样时为pH7.0±0.1。
3.1.1.2 方法:
a. 将前列四种药剂放入蒸馏水中加温溶解。
b. 以高压蒸气121℃(15磅／英寸)15分钟灭菌,如需立即使用,可盛于带盖容器内煮沸灭菌。 c. 待溶液冷至约70℃时加入灭菌亚硒酸氢钠。
d. 加入灭菌0.25克分子磷酸盐缓冲液。
e. 检查上述混合液的酸碱度应为pH7.0±0.1,如不符合要求,则用氢氧化钠溶液调节酸碱度至所需要的酸碱度。
f. 加煌绿或0.1％煌绿水溶液。
g. 分装于灭菌250毫升带盖广口瓶或其他灭菌容器内,每瓶定量分装150毫升,并于1～5日内用毕。 以上3～7项操作均以无菌操作方法进行。
3.1.1.3 试剂:
a. 亚硒酸氢钠:可称取亚硒酸氢钠按20％浓度溶于蒸馏水中,并定量分装于试管或三角瓶中,单独以121℃高压蒸气灭菌15分钟储存备用。亦可采用其他有效灭菌方法灭菌,但每管或每瓶须一次用尽,以免污染。亚硒酸氢钠每因厂牌不一,其酸碱度不一,使用前应加注意。
b. 磷酸盐缓冲溶液的配制:每因药品的纯度及含水量和蒸馏水的pH值影响其pH值,临制备前应加检查。如以无水纯磷酸盐配制,则： 磷酸氢二钾K2HPO40.25克分子溶液:称取磷酸氢二钾43.5458克溶于蒸馏水作成1000毫升,即得0.25克分子浓度的磷酸二氢钾水溶液。磷酸二氢钾KH2PO40.25克分子溶液:称取磷酸二氢钾34.0223克溶于蒸馏水中作成1000毫升,即得0.25克分子浓度的磷酸二氢钾水溶液。将以上两溶液的容量混合恰为pH7.0的缓冲液(如因药品纯度及蒸馏水酸碱度的影响, 使酸碱度不符合时,可稍加调整),并用121℃高压蒸气15分钟或其他有效灭菌法灭菌,以此液100毫升加入900毫升培养基中,即使培养基每1000毫升中含有磷酸盐0.025克分子。注：使用的磷酸盐含量应以100％计算,如纯度不够或带有结晶水时,必须用前换算。煌绿水溶液：称取煌绿0.1克溶于 100毫升蒸馏水中,即得0.1％煌绿水溶液,每1000毫升培养基中加煌绿水溶液5毫升。即使培养基每1000毫升中含有0.005克。煌绿水溶液必须新鲜,不宜久存。
3.1.1.4 几点注意事项和说明:
a. 本培养基的配制是否正确,关系到试样、药品等很多因素,为此在初次使用时,最好是先将药品及蒸馏水检查,小量试作,取得经验后再大量使用。有时药品等虽为同厂出品,但批号不同,其pH值也会有所变更,希加注意。
b. 配制本培养基的容器,避免使用铝锅,因碱性溶液与铝作用,易使培养基带有暗色。
c. 培养之基础液采用煮沸灭菌时,以五分钟为宜。
d. 亚硒酸氢钠在有还原物质的水中加热时,易被还原变为红色,因此配制溶液必须使用蒸馏水。
e. 煌绿水溶液,宜新鲜配制,储存于带盖褐色瓶中,最好当日使用,当日配制,否则影响效能。 3.1.2 远藤氏(ENDO)培养基：
3.1.2.1 材料: 无糖肉汤琼脂培养基 100毫升 乳糖 1克 10％碱性复红乙醇溶液0.5毫升 10％亚硫酸钠溶液 0.25毫升
3.1.2.2 配制方法:
a. 取无糖肉汤琼脂培养基100毫升(其中含0.5％牛肉膏,1％蛋白胨,3％琼脂)加入乳糖1克以117℃灭菌15分钟。
b. 用灭菌吸管加无菌碱性复红乙醇溶液0.5毫升。
c. 再加入新鲜配制加热煮沸的无菌10％亚硫酸钠溶液0.25毫升左右,摇动使之混和,加入量视其变成淡红色为度。
d. 分注平板凝固后,保存冷暗处备用。
3.1.3 伊红美蓝培养基:
3.1.3.1 材料: 蛋白胨10克 磷酸氢二钾(K2HPO4)2克 琼脂15克 乳糖5克 蔗糖5克 2％伊红(Y)溶液10毫升 0.5％美蓝溶液10毫升 蒸馏水1000毫升
3.1.3.2 配制方法: a. 将蛋白胨、磷酸氢二钾及琼脂溶入蒸馏水中缓缓加热,调整pH至7.2 b. 加入乳糖及蔗糖以121℃灭菌15分钟。
c. 用灭菌吸管加入无菌2％伊红溶液10毫升及0.5％美蓝溶液10毫升,摇匀,分注平板。
3.1.4 去氧胆酸盐枸橼酸盐(L.D.C)培养基:
3.1.4.1 材料: 牛肉浸液1000毫升 蛋白胨10克 琼脂18～20克 去氧胆酸钠5克 枸橼酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)20.6克 乳糖10克 枸橼酸铁铵2克 1％中性红溶液2毫升
3.1.4.2 配制方法:
a. 溶解蛋白胨于牛肉浸液中调整pH至7.5过滤加入琼脂文火溶解。
b. 除中性红外,将其他各项依次加入使之溶解,并调整pH至7.4。
c. 加入1％中性红溶液混和后分装试管或锥形瓶内,塞上棉花塞,以流通蒸气消毒15分钟(时间不宜过长,亦不需高压灭菌)。
d. 灭菌后制成平板保存备用。
3.1.5 S·S琼脂培养基:
3.1.5.1 材料: 蛋白胨5克 乳糖10克 胆盐10克 枸橼酸钠8.5克 硫代硫酸钠8.5克 枸橼酸铁0.5克 牛肉膏5克 琼脂15克 0.5％中性红溶液4.5毫升 0.1％煌绿溶液0.33毫升 蒸馏水1000毫升
3.1.5.2 配制方法:除中性红及煌绿溶液后加外,其他量混合煮沸溶解,加15％氢氧化钠溶液约1毫升,校正pH为7.0～7.2,再加入中性红与煌绿煮沸,冷至55℃左右,即可倒平板。
注：① 煌绿溶液配就后,应在十天内用掉,过久不宜使用。
② 如欲得最佳的培养结果,平板宜当日使用。
③ 本培养基切忌加高压杀菌,或过久的加热。
④ 枸橼酸钠、硫代硫酸钠对大肠杆菌有抑制作用,煌绿在这种浓度下对大肠杆菌无抑制作用,但有助于致病菌的生长。
⑤ 沙门氏菌属与志贺氏菌属细菌因不发酵乳糖,故此等菌落不着色,而呈半透明,如仍有大肠杆菌属细菌生长,则菌落呈红色或中心显红色,某些变形杆菌和沙门氏菌的菌落中心也可显异色,这是硫化氢产生的征象。
3.1.6 三醣铁琼脂斜面培养基:
3.1.6.1 材料: 蛋白胨20克 氯化钠5克 乳糖10克 蔗糖10克 葡萄糖1克 硫酸亚铁铵0.2克 硫代硫酸钠0.2克 酚红0.025克 琼脂13克 蒸馏水1000毫升
3.1.6.2 配制方法:
a. 将各物溶于蒸馏水中,加热助其溶解,调整pH为7.3分装于小试管内,每管约4毫升。
b. 置蒸气灭菌器内以117℃灭菌15～20分钟,取出后置成高层的斜面备用。
3.1.7 普通琼脂平板培养基:
3.1.7.1 材料: 琼脂20克 牛肉膏(以80％干物质计)5克 葡萄糖1克 食盐5克 蛋白胨10克 蒸馏水1000毫升
3.1.7.2 配制方法:
a. 将各物溶于蒸馏水中,加热助其溶解,校正pH为7.0。
b. 分装后以121℃灭菌15分钟。
3.1.8 乳糖胆盐发酵管:
3.1.8.1 材料: 蛋白胨20克 猪胆盐(或牛、羊胆盐)5克 乳糖10克 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液0.6毫升 (或用0.04％溴甲酚紫水溶液25毫升)蒸馏水1000毫升 pH7.4
3.1.8.2 配制方法:将蛋白胨、乳糖及胆盐溶于水,校正pH,加入指示剂,分装试管,每管10毫升或3毫升,并放入一个小导管,高压灭菌10磅15分钟。
3.1.9 试验用含糖发酵管:
3.1.9.1 材料: 蛋白胨水 100毫升 所需要之醣类 1克 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液0.1毫升 3.1.9.2 配制方法:
a. 将所需要的醣类按上项数量加入蛋白胨水中混匀使之溶解。
b. 再加入溴甲酚紫乙醇溶液,则培养基呈鲜艳的紫色。
c. 分装于灭菌的童汉(Dunham)氏发酵管中,每管约3毫升。
d. 于112℃灭菌15分钟,取出后立即放置冷水中约10分钟取出。
e. 按试验室规定的代表各种醣类的标志标记。
f. 于37℃培养箱内鉴定无菌后保存备用。
注:① 蛋白胨水可用肉膏液、血消化液等代替。
② 常用的醣类主要有葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、水杨素,阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、卫矛醇、肌醇等。
3.1.10 童汉(Dunham)氏蛋白胨水培养基:
3.1.10.1 材料: 蛋白胨 10克 氯化钠 5克 蒸馏水 1000毫升
3.1.10.2 配制方法: 将各物加热溶解于蒸馏水内,调整pH为7.4,过滤后分装于试管内。以121℃灭菌20 分钟。
3.1.11 尿毒酶试验用培养基:
3.1.11.1 材料: 酵母浸出液100毫升 磷酸二氢钾(KH2PO4)9.1克 磷酸氢二钠(Na2HPO4)9.5克 尿素2.0克 酚红0.01克 蒸馏水862.4毫升
3.1.11.2 配制方法:
a. 将上述各项除酚红外,依次加入蒸馏水中,使溶解。
b. 调整pH为6.8后加入酚红。
c. 用蔡司(seitz)滤菌器灭菌后,分装于已灭菌的小试管内,每管3毫升。
d. 如无滤菌器也可以108℃灭菌7～10分钟。
［附］酵母浸出液制法: 材料: 干酵母粉 25克 蒸馏水 1000毫升 配制方法: 将上项混合溶解搅拌均匀。 置流通蒸气消毒锅内蒸2**1/2小时。 取出静置澄清后,吸取上面清液保存备用。
3.1.12 硝酸盐培养基:
3.1.12.1 材料: 牛肉膏 3克 蛋白胨 5克 硝酸钾 1克 蒸馏水 1000毫升
3.1.12.2 配制方法: 将各物加热溶解于蒸馏水中,调整pH为7.0,以滤纸过滤后分装试管。以121℃灭菌 20分钟。
3.1.13 KCN试验用培养基:
3.1.13.1 材料: (月示)蛋白胨(proteose Peptone) 10克 氯化钠 5克 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.225克 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 5.64克 蒸馏水 1000毫升
3.1.13.2 配制方法:
a. 将上项各物混合均匀,使完全溶解。
b. 调整反应为pH7.6,用滤纸滤过后分装锥形瓶中,每瓶100毫升。于121℃灭菌30 分钟。 c. 取出后以灭菌手续加入0.5KCN溶液,于每100毫升中加入2毫升。
d. 将已加入KCN溶液的培养基,再以无菌手续分装于灭菌的小试验管中,每管约2毫升,并以灭菌的软木塞(或橡皮塞)蘸热石蜡封固。
e. 此项培养基制成后置＋4℃左右约可保存1～2周。 ［
附］ 0.5％KCN溶液。 KCN 0.5克 灭菌蒸馏水 100毫升
3.2 血清及生化反应试验
3.2.1 玻片凝集试验:
a. 取洁净玻片,火焰灭菌后,加生理食盐水一滴,再以白金耳从培养基上取菌与盐水充分混和,加入1∶50或1∶100稀释的血清一滴。
b. 将玻片前后轻轻摇动。
c. 细菌凝集成块状者即为阳性反应,如呈均等混浊而无凝集者即为阴性反应,若结块不大显著,难以决定时,可添加生理食盐水一小滴,轻轻转动后再行观察,此时如凝块显著则为阳性,反之可凝的凝块完全消除。如用放大镜或低倍显微镜观察,则更为清晰。
3.2.2 靛基质试验:
3.2.2.1 波姆(Bohme)氏法:
a. 试剂: 甲液(即欧立区氏液)： 对二甲氨苯醛4克 95％乙醇380毫升 浓盐酸80毫升 乙液:过硫酸钾饱和水溶液。
b. 方法: 将细菌接种于盛有前项童汉氏蛋白胨水培养基试管内,于37℃保温箱内培养2～3日后取出试管,加入乙醚约1毫升,摇升,待乙醚层分离后,再沿试管壁加入波姆氏试剂甲液1毫升,如1分钟后未显红色,可再加入乙液1毫升。如细菌能产生靛基质,于乙醚层内可显红色,即为阳性反应,如不显红色,即为阴性反 应。
3.2.2.2 柯凡克(Kovac)氏法: a. 试剂: 对二甲氨苯醛5克 戊醇或丁醇75毫升 浓盐酸25毫升 b. 方法: 将细菌接种于盛有童汉氏蛋白胨水培养基试管内,于37℃保温箱内培养2～4日。取出试管加入乙醚约1毫升,摇匀,待乙醚层分离后,再沿试管壁加入柯凡克试剂约0.5毫升。如果于培养液与乙醚层间的试剂层显红色,则为阳性反应,且此红色可逐渐弥散至乙醚层内。如试剂层不显红色,则为阴性反应。
3.2.3 硝酸盐还原试验:
3.2.3.1 试剂: 甲液:溶解0.4克氨基苯碘酸于50毫升5N乙酸中。 乙液:溶解0.25克α-萘胺于50毫升5N乙酸中,用蒸馏水洗过的脱脂棉过滤备用。
3.2.3.2 方法:将培养于37℃保温箱中3～5天之前项硝酸盐培养基加入甲液0.2毫升,混合后,再加入乙液数滴,如显红色即示阳性反应,表示有亚硝酸盐存在。如不显色则为阴性反应
3.2.4 尿素分解试验:
a. 将细菌培养物接种于前项尿素酶试验培养基中,置37℃培养24～48小时后观察反应。
b. 如细菌能产生尿素酶分解尿,则可形成氨,使培养液变碱性,由黄色转呈红色则为阳性反应。
c. 某些仅产生少量尿素酶的副大肠菌等,在此等培养液中仍呈阴性反应。
3.2.5 KCN试验:
3.2.5.1 培养基:见前项KCN试验用培养基。
3.2.5.2 试验方法:
a. 取前项KCN 试验用培养基,接种被检菌的24小时肉汤培养物1铂耳,然后仍将试管口用石蜡封固。
b. 置37℃培养箱中培养,每日观察一次,连续观察４日。如培养基呈混浊状态,表示细菌能在其中生长发育,如培养基仍呈澄清透明,表示细菌不能在其中生长发育。
c. 试验时应同时作空白试验对照。
大肠菌群及细菌数检验程序图解
┌─────┐
│ 检 样 │
└──┬──┘
│
┌──┴──┐
│ 稀 释 │
└──┬──┘
├──────────────┐
┌──┴─────┐ ┌─────┴─────┐
│普通琼脂平板培养│ │ 乳糖胆盐发酵管 │
└──┬─────┘ │ 35～37℃ 24±2小时 │
│ └─────┬─────┘
(培养48小时) ┌──────┴───┐
┌──┴──┐ ┌──┴──┐ ┌──┴──┐
│计算细菌数│ │ 不产气 │ │ 产 气 │
└──┬──┘ └──┬──┘ └──┬──┘
│ │ │
┌──┴──┐┌───┴───┐┌─────┴───────┐
│ 报 告 ││ 大肠菌群阴性 ││ 伊红美蓝、远藤、麦康凯琼 │
└─────┘└───┬───┘│ 脂平板 │
┌───┴──┐ │ 35～37℃ 18～24小时 │
│ 报 告 │ │ (任选一种) │
└──────┘ └─────┬───────┘
┌───────────┴─────┐
┌──┴───┐ ┌────┴────┐
│ 革兰氏染色 │ │ 乳糖发酵管 │
└──┬───┘ │35～37℃ 24±2小时│
│ └────┬────┘
┌─────┴───┐ ┌──────┴─┐
┌──┴──┐ ┌───┴──┐ ┌─┴─┐ ┌─┴─┐
│革兰氏阳性│ │ 革兰氏阴性 │ │产 气 │ │不产气│
└──┬──┘ │ 无苞胞杆菌 │ └─┬─┘ └─┬─┘
┌──┴───┐ └──┬───┘ │ ┌──┴───┐
│大肠菌群阴性│ └────┬──┘ │大肠菌群阴性│
└──┬───┘ ┌──┴───┐ └──┬───┘
┌─┴──┐ │大肠菌群阳性│ ┌──┴──┐
│ 报 告 │ └──┬───┘ │ 报 告 │
└────┘ ┌──┴───┐ └─────┘
│ 报 告 │
└──────┘
肠 道 致 病 菌 检 验 程 序 图 解
┌────────────────┐
│ 亚硒酸盐煌绿增菌培养基增菌培养 │
└───────┬────────┘
┌────────────┴───────────┐
┌────┴────┐ ┌────┴────┐
│ 伊红美蓝琼脂平板 │ │去氧胆酸盐枸橼酸盐│
│ 或远藤氏平板 │ │ 或S·S琼脂平板 │
└────┬────┘ └────┬────┘
└───────────┬────────────┴────┐
(挑取可凝菌落) │
│ │
┌─────┴─────┐ 作
│ 三醣铁琼脂斜面培养基 │ 阴
└─────┬─────┘ 性
│ 结
┌────────────┼────────────┐ 果
│ │ │ 报
(可疑志贺氏菌) (可疑沙门氏菌) (非致病菌) 告
│ │ │
┌──┴───┐ ┌────┴───┐ │
│志贺氏菌属多│ │ │ 作
│价诊断血清作│ ┌─┴─┐ ┌───┴───┐ 报
│玻片凝集反应│ │生化学│ │ 沙门氏菌属多 │ 告
└──┬───┘ │试 验│ │ 价诊断血清作 │
┌─┴─┐ └─┬─┘ │ 玻片凝集反应 │
│生化学│ │ └───┬───┘
│试 验│ │ ┌───┴───┐
└─┬─┘ │ │ 沙门氏菌属单 │
作 │ │ 价诊断血清作 │
报 │ │ 分 群 鉴 定 │
告 │ └───┬───┘
├────────┘
作
报
告
中华人民共和国商业部 发布 1982年6月15日
实施 中 国 食 品 公 司 提出 中国食品公司 起草 (责任编辑：admin)
