Mark E. Benvenuti 和 Aisling O’Connor
沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德

引言

北美地区最近出现的宠物食品污染事件突出了对宠物食品、动物饲料以及组织样品中的三聚氰胺及其代谢物（三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸）进行快速、确定性分析的必要性。如 2007 年 5 月 7 日 的《华盛顿邮报》所述，在美国，未知数量的猫狗因食用了某些品牌的宠物食品而患病或死亡。这导致了数百万磅宠物食品的召回。在食用了受污染宠物食品的动物肾脏内，发现三聚氰胺 - 三聚氰酸的结晶体迅速形成；这很可能是动物患病甚至死亡的原因。最近，公众强烈要求制造商和政府监管机构采用更准确、快速的分析方法进行食品安全性检测；而此次疾病的突发使这一呼声更加高涨。

在证实了此次污染的广泛性之后，美国食品药品管理局（ FDA ）报告称美国的三聚氰胺存在于面筋和稻米蛋白浓缩物中；这些产品均从中国进口，作为宠物食品使用 1 。动物饲料中也受到了三聚氰胺的污染 2 ，这引起了关于受污染产品可能转移至人类食品供应的担忧。

本文介绍两种方法：第一种方法是用于分析高浓度目标物质的沃特世 ® ACQUITY ® 超高效液相色谱（ UPLC ® ）光电二极管阵列法（ PDA ）；第二种方法是用于分析 ppb 级浓度的 ACQUITY UPLC ® /MS/MS 法。撰写本文时，其中的一种目标物质“三聚氰酸一酰胺”在市面上买不到；因此，未用上述方法对其进行分析。目前认为该化合物与毒性效应无关，因此对分析过程不重要。两种方法均可用不到两分钟的时间给出结果。

结果和讨论

在含水混合液中，三聚氰胺和三聚氰酸可通过氢键形成晶格结构。这阻碍了对包含这两种化合物的样品进行同步萃取和分析。三聚氰胺不与三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺反应；因此可在一次检测中，同时对这些化合物进行萃取和分析。结果表明：试验部分所述的萃取步骤适用于三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。最近，美国食品药品管理局公布了使用 SPE 萃取组织样品中的三聚氰酸的详细方法 3 。

试验

萃取宠物食品中的三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的预备程序

称量 0.10 -1 g 宠物食品
在 5-10 mL 、 2% 的氢氧化铵溶液中进行萃取
用一个 0.45 微米的注射器式滤器进行过滤
将 100 μL 滤液与 900 μL 流动相混合后进样

三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸由美国 TCI 公司提供。干狗粮从当地的一家超市中购得。三聚氰酸的标准储备液通过加水溶解而制得。三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的标准储备液通过溶解于 0.1% 的氢氧化钠水溶液而制得。标准储备液用溶于 90/10 乙腈／水的混合溶剂中 10 mM 醋酸铵进行进一步的稀释，以配制出所需的浓度水平。

UPLC 的条件

液相色谱系统： 沃特世 ACQUITY UPLC
色谱柱： ACQUITY UPLC BEH HILIC
2.1 x 100 mm 、 1.7 μm
柱温： 35 ℃
流速： 700 μL/ 分钟
流动相： 溶于 90/10 乙腈／水的 10 mM 醋酸铵
进样量： 5 μL
ACQUITY PDA ： 200 -300 nm

质谱条件

质谱系统： 沃特世 ACQUITY TQD
软件： 沃特世 MassLynx™ 第 4.1 版
电离模式： ESI 正离子（三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺）
ESI 负离子（三聚氰酸）
毛细管电压： 3 kV
脱溶剂气： 氮气， 900 L ／小时
锥孔气： 氮气， 50 L ／小时
源温度： 150 ˚C
脱溶剂气温度： 400 ˚C
采集： 多反应监测（ MRM ）
碰撞气： 氩气， 3.5 x 10 -3 毫巴

对每种化合物采集两种多反应监测（ MRM ）的跃迁数据。主要跃迁用于定量分析，次要跃迁用于确认。 MRM 的跃迁、停顿时间、优化后的碰撞能量以及锥孔电压见表 1 。

表 1. 受监测的 MS/MS 离子跃迁（ ESI 正离子），三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺；（ ESI 负离子）三聚氰酸

第 1 部分： UPLC /MS/MS 分析

ACQUITY UPLC-TQD 台顶式串联四极杆质谱仪可用不到 1.5 分钟的时间完成对三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的分离和确认。参见图 3 。 ACQUITY UPLC BEH HILIC 色谱柱可给出清晰的峰形，从而可对宠物食品和面筋型样品进行可信的定量分析。为实现准确定量，组织样品的分析通常需要使用一种同位素标记型内标。本文未对组织样品的分析进行说明，这是因为目前没有适用于这些化合物的同位素标记型内标。

三聚氰酸在另一次检测中进行分析，所用的色谱条件与三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的分析条件相同。图 4 给出了氰尿酸的一幅 UPLC/MS/MS 色谱图。

图 5 给出了萃取得到的一种三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺加标型干狗粮样品。沃特世 TargetLynx™ 应用管理软件可自动处理数据并报告定量分析结果；该软件通过计算每种化合物的主要和次要 MRM 跃迁之间的离子比，可确定是否存在三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。图 6 给出了关于三聚氰酸二酰胺的 TargetLynx 浏览器界面。

第 2 部分： UPLC/PDA 分析

图 7 给出了使用 PDA 检测型 ACQUITY UPLC 分离三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的加标型宠物食品的典型过程，该分离过程需时不到 1.5 分钟。该分离使用相同的 ACQUITY BEH HILIC 2.1 x 100 mm 色谱柱，所用的流动相构成也与串联四极杆质谱法相同。结果表明这两种化合物的校准曲线在 1-25 ppm 的范围内呈线性。

三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的色谱峰可根据保留时间而轻松鉴定，并可通过积分进行定量分析。在图 7 中， 1 分钟处的未知峰在 221 nm 下出现λ最大值。检测三聚氰酸二酰胺的纯标准品时，观察到一个具有相近保留时间和λ最大值的色谱峰；因此认定其为三聚氰酸二酰胺的一种杂质。紧邻三聚氰酸二酰胺峰的第二个未知峰在 236 nm 下出现λ最大值，与未加标型狗粮的色谱峰相近。

除了保留时间的完全匹配之外，通过使用 PDA 和 Empower™ 软件的 UV 光谱库功能，也能提高成分鉴别的可信度。图 8 和图 9 分别给出了 10 ppm 三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺标准品以及 10 ppm 三聚氰酸标准品的光谱指数图。图 10 给出了一幅用以确认三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺加标型宠物食物样品的光谱匹配情况的光谱指数图

结论

ACQUITY UPLC - 台顶式串联四极杆质谱仪（ TQD ）可提供更高的灵敏度和质量特异度，从而可用不到 2 分钟的时间定量检出 ppb 水平的三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。使用次要的 MRM 离子跃迁可对加标型狗粮中是否存在三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺进行确认。由于存在形成三聚氰胺 - 三聚氰酸结晶体的风险，因此三聚氰酸在另一次色谱检测中进行分析。

当不需要较高的灵敏度和质量特异度时， ACQUITY UPLC PDA 检测可作为 UPLC/MS/MS 的一种快速而划算的替代方法。快速分析三聚氰胺及其代谢物的能力可简化与质控或产品合规相关的工作流程。

参考文献

1. 《华盛顿邮报》的网址： http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/article/ 2007/05/06 /AR2007050601034.html

2. FDA 的网址： http://www.fda.gov/oc/opacom/hottopics/petfood.html

3. 在线文章： http://www.flworkshop.com/ ，“用 LC-MS/MS 测定组织中的三聚氰胺和三聚氰酸的简化方法”，由 FDA 方法开发分部的 Alexander J. Krynitsky 撰写